蛋白质电泳技术.ppt

1、电泳技术,段天璇,一、基本理论,1. 常用公式和术语 E=U/L电场强度(V/cm)=电压(V)/电极间距(cm) *相对迁移率 mR=蛋白质迁移距离/示踪染料迁移距离 ep=v/E =l/(tE)=lL/(tU) =q/(6r) (cm2/(s*V) F=qE =F=6rvl：蛋白质迁移距离 电泳速度v=epE=epJ/K 分离度,影响电泳的环境因素,电泳速度 v=epE= E/(C) C: 6or 4 E pH: pI(4-7), 缓冲溶液pH(8-9.5), 向？极泳动 离子强度I: 0.02-0.2 电渗 温度：焦耳热 介质：孔径、制胶重复性等,2. 分类,按原理: 区带电泳, (移界

2、电泳), 稳态电泳, 显微电泳,3. 电泳仪及附属设备,提供稳定直流电源的装置 电压、电流、电功率稳定 脉冲式 电压 常压电泳仪(600V): 净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 高压电泳仪(3kV): 载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序 超高压电泳(30-50kV): 毛细管电泳,电泳槽 板状电泳槽 水平板 垂直板 管状电泳槽 *自由界面电泳槽,DYCP-33A型 琼脂糖水平电泳仪(槽)(中号),DYCZ-22B型单垂直电泳仪(槽)（大号）,4.电泳的支持介质,特性（要求） 物理化学性质稳定 化学惰性 均匀 种类,5.检测-染色方法,考马斯亮蓝：常用 荧光染料：灵敏 硝酸银：灵敏 酶活性

3、 免疫学：专一 特殊蛋白质 糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白,三苯基甲烷衍生物，-SO3-蛋白质的碱性基团染料-蛋白质复合物。 R型 G型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍生物 染色 固定蛋白质-染色-脱色 同时固定和染色-脱色 脱色 30%甲醇的10%乙酸溶液等,二、琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis,支持介质：琼脂糖 结构：1,3连接的-D半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构 特点：大孔胶，适于核酸、线性DNA, RNA分离分析 分离原理：0.2-50kb 操作形式：水平电泳、免疫 电泳、平板

4、等电聚焦,Agarose,D-galactose,3,6-anhydro L-galactose,性能指标 电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用 纯度：硫酸根含量少，纯度高 应用：核酸研究, 不同浓度凝胶分离 200bp-50kb DNA 检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色 操作过程： 见Agarose Gel Electrophoresis.ppt,三、醋酸纤维素薄膜cellulose acetate film,纤维素-乙酰化 特点 定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色 较快速：电渗小 灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质 薄膜可保存 操作简单快速价廉 应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、

5、糖蛋白、脱氢酶、多肽等,四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE,以polyacrylamide gel为分离介质 分离原理：电荷密度+分子筛 特点 应用领域 操作形式 (圆盘电泳) 垂直板电泳 水平板电泳,1.聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamide gel, PAG,聚合 化学聚合 光聚合 总浓度与交联度,单体交联剂催化剂 丙烯酰胺 +N,N-亚甲基双丙烯酰胺 PAG AcrBis加速剂,总浓度与交联度的影响,凝胶浓度 T=(a+b)/m 100% (g/mL) 交联度 C= b/(a+b) 100% a=mAcr; b=mBis; m=V a/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等 C=6.5-0.

6、3T 浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶,凝胶孔径,2. 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959),凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变 分离原理：样品电荷 特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高 适用：简单样品,3. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳,含义：不同胶孔径、不同缓冲液 分离原理：电荷效应+分子筛效应 特点：样品成分浓缩-分离，分辨率高；操作复杂 适用：广泛应用的主要电泳技术 3种物理效应 样品浓缩；分子筛效应；电荷效应,不连续性 凝胶浓度：浓缩胶-分离胶 缓冲液离子成分 缓冲液pH 电位梯度,制胶,分 离 胶,样品胶 浓缩胶,4. SDS-PAGE,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

7、 分离原理: 分子筛-分子相对分子质量 蛋白质-SDS复合物呈棒状且大量带电(-),消除样品蛋白质分子间电荷差异 应用：蛋白质纯度检测和相对分子量测定 操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶,SDS-PAGE,操作特点 样品: 制胶： 缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含SDS 等 分子量的确定 染色 考马斯亮蓝-蛋白质吸附量-近似Beer定律 其他染色 计算标准蛋白质mR，作lgMr-mR标准曲线 待测蛋白mR - Mr,同时测定,5. 梯度凝胶电泳,分离胶浓度为线性或指数梯度 分离原理：蛋白质分子大小 T 4-30%, Mr 5万-200万，分辨较小Mr差异 可不与SDS反应，与SD

8、S-PAGE互补 常加入SDS 制胶：梯度混合器,五、等电聚焦电泳isoelectric focusing IEF,分离原理：利用pH梯度的介质分离pI不同的蛋白质 分辨率pI相差0.01-0.001 适用 研究蛋白质微观不均一性 测定蛋白质等电点 操作形式: 水平平板、(管式),获得pH梯度 人工pH梯度: 不稳定，可用于制备 自然pH梯度 载体两性电解质：一系列pI不同的多氨基多羧基混合物(合成过程产生连续变化的氨基羧基比) 不同pH范围 NH2-R-COO-NH2-R-COOHNH3+-R-COOH,- 高pH 电极液,+ 低pH 电极液,高pI不同pI混合物低pI 高pH 两性缓冲 低

9、pH,等电聚焦 支持介质 聚丙烯酰胺应用较多 避免分子筛作用 薄膜-散热与经济 加样方式 放大作用 检测 固定 脱色：除去两性电解质 染色,六、双向电泳 2DE,第一次电泳后，在垂直方向再进行一次电泳 单向电泳100种蛋白质 双向电泳5000-8000种蛋白质(圆点) 组合方式： 第一向等电聚焦(pI)，第二向SDS-聚丙烯酰胺均匀/梯度胶电泳(Mr分离)为多,I.E.F. and 2D GE,/ch2d/,七、蛋白质印记,将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品 分离：高分辨电泳技术 检测：灵敏、专一的免疫探测技术 探针：用化学方法将有识别能力的物质(抗原、核酸等)和酶或同位素、