《甘蔗感染黑穗病的鉴定方法 PCR 法》（征求意见稿）编制说明

1、广西地方标准甘蔗感染黑穗病的鉴定方法 PCR 法（征求意见稿）编制说明 一、制定意义及任务来源1目的意义甘蔗是广西的主要经济作物，甘蔗中含有丰富的糖分、水分，还含有对人体新陈代谢非常有益的各种维生素、脂肪、蛋白质、有机酸、钙、铁等物质，主要用于制糖。2018年广西甘蔗种植面积达886.40千公顷。甘蔗黑穗病别称甘蔗鞭黑穗病、黑粉病，甘蔗常见病害，病原是担子菌亚门孢堆黑粉菌属甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）。目前，中国甘蔗主栽品种普遍感染黑穗病，田间黑穗病发生率超过10%，有的田块甚至超过50%，经济损失严重，给中国甘蔗安全生产带来了严重隐患。甘蔗黑穗病主要侵染芽，

2、发病严重时大量蔗株不能正常生长，使有效茎数减少，造成减产。甘蔗黑穗病不但造成甘蔗产量损失，还使蔗糖分降低、严重影响甘蔗品质。甘蔗黑穗病发病潜伏期较长，早期无症状难以确定；利用聚合酶链式反应（PCR）技术可在甘蔗分蘖期快速鉴定出甘蔗的黑穗病，可以广泛应用于甘蔗黑穗病病害的早期预测、诊断、引种检疫与健康组培苗感染黑穗病敏感性评价等生产过程，对提高甘蔗产业经济效益具有重要的意义和有促进作用。因此，开展本项目研究，提升该检测方法为地方标准，对提高广西甘蔗产业经济效益具有重要的意义和促进作用。而目前无利用PCR技术鉴定甘蔗感染黑穗病的方法标准。2 任务来源2015年由广西分析测试研究中心提出的甘蔗感染黑

3、穗病的鉴定方法 PCR 法的制定计划，2015年广西壮族自治区质量技术监督局在关于下达2015年第二批广西地方标准制定（修订）项目计划的通知附件文中批准将其列入2015年第二批广西地方标准制定（修订）项目计划(序号：2015-0284)，由广西分析测试研究中心和广西益谱检测技术有限公司等主要负责起草该地方标准的制定任务。二、工作概述1 国内外相关研究目前，国内外报道甘蔗黑穗病是由鞭黑粉菌（Ustilago scitaminea Syd）引起的一种真菌病害，该菌是担子菌亚门黑粉菌目黑粉菌科的真菌。以甘蔗鞭黑粉菌的厚垣孢子侵染幼嫩蔗种或其他营养部分而使甘蔗产生病变。由于干旱的生态条件较有利于甘蔗黑

4、穗病冬孢子的传播，以及中国蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种的变化及蔗区主栽品种的单一化，导致中国蔗区甘蔗黑穗病的发生逐年加重。造成严重经济损失，给国内甘蔗安全生产带来了严重隐患。甘蔗黑穗病最典型的症状是蔗茎生长点变异产生黑色鞭状物，是甘蔗病害中最容易诊断的病害，但其发病潜伏期较长，早期无症状的甘蔗小苗或甘蔗种茎一般方法难以准确诊断其是否感染或携带甘蔗黑穗病菌，而目前农作物病害早期检测多运用PCR技术。目前国内尚无利用PCR鉴定甘蔗黑穗病的方法标准。2 编写讨论稿，形成征求意见稿在广泛的调查研究和试验验证的工作基础上，根据GB/T1.1标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写、标准的编写所规定的内容和

5、格式编写完成该标准讨论稿，选取3家单位作为验证单位，对标准讨论稿进行比对试验，验证本方法的可行性，形成征求意见稿。三、标准主要内容及依据 标准编写主要内容包括样品处理、聚合酶链式反应法（PCR）操作过程以及结果判定，适用于甘蔗黑穗病的检测。标准的建立过程主要进行了以下实验：1 试剂设备与材料1.1样品来源样品来自广西农业科学院甘蔗所。1.2主要试剂十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、Tris、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、氯化钠、氯仿、无水乙醇、TE溶液、琼脂糖、硼酸、DNA相对分子质量标记。1.3设备高速冷冻离心机、水浴锅、PCR仪、水平电泳装置、凝胶成像系统。1.4引物序列正向引物bE4：5

6、-CGCTCTGGTTCATCAACG-3，反向引物bE8：5-TGCTGTCGATGGAAGGTGT-3，预期扩增片段大小为420bp。1.5 操作步骤取100 mg样品于研钵中，加入液氮研磨成粉末状，装入2 ml离心管中，加入750 LCTAB于样品管中，65水浴45 min，隔15 min轻微颠倒混匀，加500 L氯仿，颠倒混匀，12 000 r/min，离心3 min，吸上清500 L到新的离心管中，加等量冰冻过的无水乙醇，在冰箱冷冻8 min，12 000 r/min，离心3 min，倒掉上清，放在纸上晾干，加超纯水溶解。1.6 PCR扩增反应1.6.1 PCR反应体系PCR反应体系

7、见表1。表1 PCR反应体系试剂体积水1L2Es TaqMasterMix5L10M正向引物1.0L10M反向引物1.0LDNA模板2.0L总体积10.0L1.6.2 PCR扩增程序预变性94，4min；35次循环94变性30s，55退火30s，72延伸1min；延伸反应72，10min。1.7扩增产物的电泳检测将适量的琼脂糖加入0.5TBE缓冲液中，加热将其溶解，配制成琼脂糖浓度为1的溶液，然后按每100ml琼脂糖溶液中加入5lGel-Red核酸染料的比例，混匀，稍适冷却后，将其倒在电泳板上，室温下凝固成凝胶后，放入0.5TBE缓冲液中。在每个泳道中加入2.5l的PCR产物（需和上样缓冲液混

8、合），其中一个泳道加入DNA分子量标记，接通电源进行电泳。1.8 凝胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶电泳置于凝胶成像系统成像仪上或紫外透射仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，并将电泳结果用照相系统拍照，根据有无特异扩增带（420bp）检测样品有无甘蔗黑穗病菌。1.9 试验成立的条件以水为空白对照，以感染甘蔗黑穗病的病株为阳性对照，以甘蔗无病种苗基因组DNA为阴性对照。阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性条带，阴性对照的扩增产物经电泳检测均没有预期大小的目的条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效。1.10结果判定1.10.1 阳性判定如果阳性对照和检测样品中同时出现目的扩增条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性；1.10.2 阴性判定如果阳性对照出现目的扩增条带，而阴性对照、空白对照及检测样品中均不出现该条带，则该样品判为阴性；2结