《SSR分子标记鉴定甘蔗品种真伪技术方法》（征求意见稿）

1、ICS65.020.20B 05DB45广西壮族自治区地方标准DB 45/T SSR分子标记鉴定甘蔗品种真伪技术方法Method of SSR Molecular Markers in Authenticity Identification of Sugarcane Varieties点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：） - - 发布 - - 实施广西壮族自治区市场监督管理局 发布DB 45/T 目次前言II1范围12规范性引用文件13术语和定义14原理15仪器16试剂17SSR引物18操作步骤29数据记录与统计310判定方法3附录A（规范性附录）推荐引物4前言本标准按照G

2、B/T 1.12009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本标准由归口。本标准起草单位：广西益谱检测技术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心、广西博测检测技术服务有限公司。本标准主要起草人：。8SSR分子标记鉴定甘蔗品种真伪技术方法1 范围本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats.SSR）标记进行甘蔗（Saccharum officinarum）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。本标准适用于甘蔗品种的SSR指纹数据采集及品种鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日

3、期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/ T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义3.1 推荐引物 recommended primer品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，其检测位点多态性高，检测结果重复性好。4 原理由于不同甘蔗品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数有差异。这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同品种。5 仪器高速冷冻离心机、水浴锅、PCR仪、毛细管电泳仪、凝胶成像系统。6 试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂，实验室用水应符合GB/T 6682。所用

4、试剂：氯仿、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、4种脱氧核糖核苷酸、Taq DNA聚合酶、DNA分子量标准（DNA片段分布范围至少在50 bp500 bp，该范围内DNA片段之间大小最小差异不高于100bp）、无水乙醇、CTAB提取溶液（5.00gCATB，16.38gNaCl，1.21g Tris，1.49g EDTA，用适量水溶解后，调节pH，定容至200ml，高压灭菌）、DNA分析仪用丙烯酰胺胶液、DNA分析仪用分子量内标LIZ500、DNA分析仪用光谱校准基质（包括 FAM、NED、VIC和 PET 4种 DNA 片段）、DNA 分析仪用电泳缓冲液。7 SSR引物引物序列见附录

5、A8 操作步骤8.1 DNA的提取将待检甘蔗叶片剪碎，放入研钵中，加入液氮研磨成粉末状，取100mg放入1.5ml离心管中，加入750lCTAB提取溶液，涡旋振荡混匀后于65温育45min，期间颠倒混匀离心管2次3次，加人500l的氯仿，颠倒混匀，12000 r/min，离心3min，转移上清液至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的无水乙醇，于-20下静置8min，12000 r/min，离心3min，小心弃去上清液，室温下或核酸真空干燥系统中挥干液体。加50l超纯水，4保存备用。注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本标准。8.2 PCR扩增8

6、.2.1 反应体系PCR反应体系见表1。表1 PCR反应体系试剂体积水22l2Es Taq MasterMix 25l10M正向引物1.0l10M反向引物1.0l25mg/L DNA模板1.0l总体积50.0l8.2.2 反应程序94预变性2min；35个循环：94变性30s，退火30s（退火温度见引物表），72延伸30s；最后72下延伸2min。8.3 扩增产物检测8.3.1 毛细管电泳检测8.3.1.1 PCR产物样品准备分别取等体积的稀释后的不同标记扩增产物溶液混合，从混合液中吸取1L加入到DNA分析仪专用96孔板孔中 。板中各孔分别加入0.1L分子量内标和8.9L去离子甲酰胺 。将样品

7、在PCR仪上95变性5min，取出，迅速置于冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上。8.3.1.2 电泳检测 按照仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。8.3.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测8.3.2.1 凝胶制备在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，将玻璃板对齐夹紧，在封口处注入琼脂糖溶液，让其凝固密封。在烧杯中依次加入7.5mL 5X TBE缓冲液，7.5mL 40%丙烯酰胺溶液，搅拌并用双蒸水定容至30ml；然后加入200L 10%过硫酸铵和12L TEMED，混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50min60min内聚合凝固，凝胶高度

8、应不小于10cm。8.3.2.2 电泳将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入1TBE缓冲液，小心拔下梳子。用加样器吸取1l PCR产物，点入加样孔中，同时在同一块胶中加入分子量标记。电泳选用的电压梯度为1V/cm-5V/cm，指示带从上到下应分别到达胶板1/2、2/3处（大约1h）后，可结束电泳。8.3.2.3 银染显色将附着凝胶的玻璃板用双蒸水冲洗30s60s后，放入染色液中，轻摇5min10min进行染色；从染色液中取出，用水快速漂洗，放入显影液中，轻摇至显色出清晰带纹；取出凝胶用双蒸水冲洗两遍，沥干后进行拍照。9 数据记录与统计样品每个SSR位点的等位变异采用扩增片段长度的形式表示。

9、对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测方法，将每个扩增位点的等位变异与相应的对照品种的等位变异片段大小进行比较，确定待检样品在该位点的等位变异。对于毛细管电泳检测方法，通过使用对照品种，消除同型号不同批次间或不同型号DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取待检样品在该位点的等位变异。10 判定方法当待检样品和对照品种间差异位点数2，则判定为 “不同品种”；当待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定为 “ 近似品种” ；当样品间差异位点数=0，判定为 “ 极近似品种或相同品种”。AA附录A （规范性附录）推荐引物推荐引物见表A.1表 A.1 引物编号及引物扩增信息引物名称条带大小（B

10、p）引物退火温度（）引物序列（53）SMC7CUQ158-17160正向：GCC AAA GCA AGG GTC ACT AGA 反向：AGC TCT ATC AGT TGA AAC CGAmSSCIR36100-18054正向：CAACAATAACTTAACTGGTA反向：CTGTCCTTTTTATTCTCTTTSMC182560-12056正向：CACGTCCTTCCGCCTTGA反向：TCATCGTTCGTCGCACTGSMC24DUQ121-14264正向：CGC AAC GAC ATA TAC ACT TCG G反向：CGA CAT CAC GGA GCA ATC AGTSMC31C

11、UQ138-18562正向：CAT GCC AAC TTC CAA TAC AGA CT反向：AGT GCC AAT CCA TCT CAG AGASMC36BUQ104-25464正向：GGG TTT CAT CTC TAG CCT ACC反向：TCA GTA GCA GAG TCA GAC GCT TSMC119CG105-13158正向：TTC ATC TCT AGC CTA CCC CAA反向：AGC AGC CAT TTA CCC AGG ASMC278CS140-18264正向：TTC TAG TGC CAA TCC ATC TCA GA反向：CAT GCC AAC TTC CAA

12、 ACA GAC TSMC334BS132-16560正向：CAA TTC TGA CCG TGC AAA GAT反向：CGA TGA GCT TGA TTG CGA ATGSMC336BS141-18562正向：ATT CTA GTG CCA ATC CAT CTC A反向：CAT GCC AAC TTC CAA ACA GACSMC486CG224-24558正向：GAA ATT GCC TCC CAG GAT TA反向：CCA ACT TGA GAA TTG AGA TTC GSMC569CS165-23362正向：GCG ATG GTT CCT ATG CAA CTT反向：TTC GT

13、G GCT GAG ATT CAC ACT ASMC597CS144-17964正向：GCA CAC CAC TCG AAT AAC GGA T反向：AGT ATA TCG TCC CTG GCA TTC ASMC703BS203-22962正向：GCC TTT CTC CAA ACC AAT TAG T反向：GTT GTT TAT GGA ATG GTG AGG ASMC851MS127-15258正向：ACT AAA ATG GCA AGG GTG GT反向：CGT GAG CCC ACA TAT CAT GCSMC1604SA92-12758正向：AGG GAA AAG GTA GCC

14、TTG G反向：TTC CAA CAG ACT TGG GTG GSMC1751CL134-15460正向：GCC ATG CCC ATG CTA AAG AT 反向：ACG TTG GTC CCG GAA CCGmSSCIR3160-190 60正向：ATA GCT CCC ACA CCA AAT GC 反向：GGA CTA CTC CAC AAT GAT GCmSSCIR43168-25252正向：ATT CAA CGA TTT TCA CGA G反向：AAC CTA GCA ATT TAC AAG AGmSSCIR66122-14648正向：AGG TGA TTT AGC AGC ATA

15、反向：CAC AAA TAA ACC CAA TGAmSSCIR64217-30054正向：ATTGGATTCCTTCTGCTA反向：CATCACAACAGGTTTCAGSMC123790-16058正向：TTCACGAACACCCCACCTA反向：GCGCCAGGTAACCTACTGAASMC1814120-19064正向：GGTTGACGATGAGAAGGACGTG反向：CACCCACATAGTGCCCAACGSMC286100-20058正向：TCAAATGGGACCTTATTGGAG反向：TCCCTCGATCTCCGTTGTTUGSM1098-12558正向：GCTACTATGGACAACAGGG反向：ATGAAGAGACGAGACGAAGAUGSM97171-18152正向：ATAACACACACACACACAAA反向：TTCCGAGGGCAAATAATC