生物技术大实验指导

1、河北联合大学生命科学学院分子生物学技术大实验操作指导手册生物工程系二零一二年五月目 录实验一 PCR技术体外扩增DNA片段.3实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA.4实验三 DNA 片段的凝胶回收.5实验四 DNA的重组技术.7实验五 转化及重组子的筛选.9实验六 质粒DNA的提取.11实验七 克隆子的鉴定.13实验八 SDSPAGE测蛋白质的分子量.15实验九 WESTERN BLOT检测蛋白.18实验十、凝胶图谱分析.18实验一 PCR技术体外扩增DNA片段实验目的 通过本实验学习PCR反应的基本原理和实验技术。实验原理 多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PC

2、R）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段的两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。经变性、退火和延伸若干循环后，DNA扩增2n倍。1变性：加热使模板DNA在高温下（94）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。2退火：使溶液温度降至50-60，模板DNA 与引物按碱基配对原则互补。3延伸：在DNA聚合酶的作用下，以单链DNA为模板，利用四种脱氧核苷酸，按53的方向复制出与模板互补的DNA链。上述三步为一个循环，每经过一个循环，样品中的DNA量应增加一倍，新形成的链又可作为新一轮循环的模板。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液

3、、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物和耐热Taq聚合酶。仪器 PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，各种规格的移液器，制冰机等试剂：特定大小产物PCR反应试剂盒（500 bp）1. DNA模板： pBS500 1-2 ng/ ml 2. Taq DNA聚合酶 2.5 U dNTP混和物 2.5 mM each 10 Taq buffer (MgCl2 15 mM) 3. 引物1、引物2 (10 mM)4. ddH2O 5. 琼脂糖 6. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）实验步骤：1 .实验体系的建立：根据以下的反应体系向管中加入各种成分。PCR反应体系(各种成分单独加入)

4、以下举例为常规PCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物长短等具体情况，设定最佳反应条件。50 ml反应体系如下(可根据比例放大或缩小反应体系)：Template（pBS500）4 mlPrimer 1（10 mM）2 mlPrimer 2（10 mM）2 ml10Taq Buffer5 mldNTP Mixture(2.5 mM)4 mlTaq (2.5 U/ml)1 mlddH2O补至 50 ml 2. 94 2 min94 30 sec55 30 sec 35 cycles 72 30 sec72 5 min3. 结果

5、检测：反应结束后取5 ml反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。实验二 琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验目的 通过本实验学习用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理 琼脂糖凝胶电泳分离DNA的能力是通过电荷效应和分子筛效应来完成的。DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中从负极向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速率与相对分子量的对数值成反比关系。在相对分子量相同的情况下，DNA分子的迁移速率依次为：超螺旋状DNA 带切口环状DNA 线形DNA。凝胶中琼

6、脂糖的百分含量由被分离的DNA大小决定（参照下表）。电泳后的凝胶经溴化乙锭荧光染料染色，根据与DNA相对分子量标准物的比较，即可确定DNA片段的大小。琼脂糖凝胶浓度% 线性DNA的有效分离范围Kb 0.3 5-600.6 1-200.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-42.0 0.1-3仪器 琼脂糖凝胶电泳系统， 紫外透射箱或凝聚图像分析仪试剂 1. 0.5 TBE电泳缓冲液2. 6 上样缓冲液3. 琼脂糖4. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）5. 溴化乙锭（EB） 用水配制成10 mg/ml的溶液，使用浓度为0.5 mg/ml。注意：溴化乙锭是

7、一种强诱变剂并有中度毒性。使用含此染料的溶液时必须带手套。使用后的溶液和物品应专门处理，不要随意丢弃。实验步骤（一）制备1%的琼脂糖凝胶称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100 ml的0.5 TBE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，冷却到60左右，加入5-10 ml 的10 mg/ml溴化乙锭溶液后摇匀。（二）胶板的制备1. 用隔板将胶板的两端边缘封闭好。2. 将胶板放在水平处，放好样品梳子(注意梳子底部距离胶板1-2 mm )。3. 将冷却到60左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶厚度在8 mm之间。4. 待胶凝固后，取出梳子，取下隔板，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负

8、极）。5. 向电泳槽中加入0.5 TBE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。（三）加样1. 在样品中加入适量的6 上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1。2. 用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）（四）电泳1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5 V/cm。2. 当溴酚蓝染料移动到凝胶的1/2 2/3 处时，停止电泳。（五）观察实验结果在紫外灯（360 nm或254 nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。实验三 DNA 片段的凝胶回收实验目的

9、从琼脂糖凝胶中回收目的DNA条带。目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。目前待回收的片段主要有酶切片段和各种PCR片段。回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、离心柱回收、玻璃奶回收和透析袋大量回收等，下面介绍离心柱回收技术。实验原理采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。可回收100 bp10 kb大小的片段。本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收。仪器：琼脂糖凝胶电泳系统

10、，紫外透射箱，电子天平，高速冷冻离心机试剂：1. 0.5 TBE电泳缓冲液2. 6 上样缓冲液3. 琼脂糖4. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）5. 溴化乙锭（EB）6.无水乙醇7.离心柱型 普通 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒注意事项：1. 电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。2. 如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液。3. 切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。4. 如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5,可向含有DNA的胶溶液中加1030 l 3 M醋酸钠（pH 5.2）将pH值调到57之间。5. 回收10k

11、b的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。实验步骤1. 紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。2. 向胶块中加入3倍体积溶胶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 l，则加入300 l溶胶液），50水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。(胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱)。3. 将上一步所得溶液加入一个吸

12、附柱CB1或CB2中（依所购买的试剂盒种类而定）（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。4. 向吸附柱中加入700 l漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 13,000 rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。5. 向吸附柱中加入500 l漂洗液PW， 13,000 rpm离心30秒，倒掉废液。将离心吸附柱CB1或CB2放回收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50温箱数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。如果漂洗液有残留会影响回收效率和DNA质量。6

13、 将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量6570水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液。7 为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6。CB1柱的洗脱体积不应少于20 l，CB2柱的洗脱体积不应小于30 l过小影响回收效率。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。也可用TE buffer (10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)作为洗脱缓冲液，但ED

14、TA会影响后续的酶反应等实验。实验四 DNA的重组技术实验目的 通过本实验学习DNA重组的原理和技术。实验原理 DNA重组，即外源DNA分子与载体分子的连接，实际上是指在双链DNA的5磷酸和相邻的3羟基之间形成新的共价键。进行DNA连接的方法有很多，主要有粘端连接法和平端连接法。后者还包括平接法和接头法，以及平-粘连接法。选择这些方法的依据主要是外源DNA片段和质粒载体的末端以及它们限制性内切酶酶切位点的性质（参见下表）。外源DNA片段末端克隆的要求说明平端高浓度的DNA和连接酶1. 非重组体克隆的背景可能很高 2. 载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点消失3. 重组质粒会带有外源DNA的串

15、联拷贝不同的突出端用两种限制酶消化后，需纯化1. 载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点可保留质粒载体以尽量提高连接效率 2. 非重组体克隆的背景较低3. 外源DNA以一个方向插到重组质粒中相同的突出端线形质粒DNA常用磷酸酶处理1. 载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点可保留 2. 外源DNA以两个方向插入 3. 重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝 DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。这两种DNA连接酶都具有将相同粘性末端的DNA分子连接在一起的功能。而T4噬菌体DNA连接酶还具有将两个平头末端的双链DNA分子连接在一起的活性，但后者的连接效率往往低于前者的连

16、接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先，T4噬菌体DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶AMP复合物再结合到具有5磷酸基和3羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，封住切口。许多耐热DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶等扩增的PCR产物在3-末端后都带有一个突出的碱基A，而T 载体的3-末端后都带有一个突出的碱基T，因此，T 载体是适用于克隆带有3-末端A突出的PCR产物的克隆载体。而且T 载体具有半乳糖苷酶阅读框，可通过蓝白斑筛选阳性克隆。仪器 恒温水浴试剂: pGM-T 克隆试剂盒：20次2 pGM

17、-T 载体(50 ng/l)20 l T4 DNA Ligase (3 U/l)20 l10Ligation Buffer I50 l2Ligation Buffer II100 l对照插入片段（700 bp, 50 ng/l）10 l无菌去离子水1 mlTOP10感受态(100 l/管)10 管pUC19（0.1 ng/l）10 l 实验步骤: （以下操作在无菌环境下进行）1将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一份），短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。2按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1：3 1：

18、8，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片段反而会干扰连接反应。注：每个连接体系只从10Ligation Buffer I或 2Ligation Buffer II中任选一种，请不要同时加到一个管中。连接体系中的成分反应体系阳性对照目的PCR 片段X l-对照插入片段（700 bp, 50 ng/l）-1lpGM-T Easy 载体1 l1 lLigase1 l1 l10Ligation Buffer I （或 2Ligation Buffer II1 l5l1 l 5 l） 无菌去离子水补足到10 l补足到10 l3 轻轻弹动离心管以混合内

19、容物，短暂离心。 使用10Ligation Buffer I 的连接体系置于16过夜； 使用2Ligation Buffer II的连接反应体系置于25水浴反应10 分钟后，将离心管置于冰上。（建议最好使用10Ligation Buffer I 的连接体系并置于16过夜， 以达到更满意的连接效果）实验五 转化及重组子的筛选实验目的 通过本实验学习转化及通过蓝白斑筛选重组子的原理和技术。实验原理 转化是指将质粒DNA或构建的重组子导入细胞的过程。细菌细胞在低温，低渗（CaCl2溶液）中膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成了抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。经42短时间热激处理后，促进

20、了细胞吸收DNA复合物。重组质粒转化宿主细胞后，还需要对转化菌落进行筛选鉴定。通过互补进行筛选是最常用的鉴定方法之一。目前实验使用的许多载体都具有一段大肠杆菌半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链的DNA序列，此结构称为laz 基因。laz 基因编码的肽链与失去正常氨基末端的半乳糖苷酶突变体互补，产生具有功能活性的半乳糖苷酶分子，这种现象称为互补。在IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）的诱导下，半乳糖苷酶能将X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带laz 基因的质粒载体转化到半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，都会在涂有IPTG和X-Ga

21、l的培养基平板上形成蓝色菌落。当有外源DNA片段插入到位于laz 中的多克隆位点后，就破坏了肽链的阅读框，从而无法形成互补，不能产生具有功能活性的半乳糖苷酶，因此含有外源DNA片段的重组子的克隆在涂有IPTG和X-Gal的培养基平板上是白色菌落。仪器 超净工作台，恒温摇床，恒温培养箱，恒温水浴器试剂1. 氨苄青霉素（Amp）用无菌水配制成100 mg/mL的溶液，分装，不用高压灭菌，-20保存。2. 50 mg/ml的IPTG 取0.5 g IPTG溶于8 mL双蒸水中，待完全溶解后补至10mL，用0.22m滤膜过滤除菌，分装成小份，-20保存。3. 将X-Gal溶于二甲基甲酰胺，配成20 m

22、g/mL，不需过滤除菌，分装后避光保存于-20。4.LB液体和固体培养基LB培养基 1000 mL 细菌培养用的酵母抽提物（yeast extract） 5 g细菌培养用的胰蛋白胨（Bactopeptone） 10 gNaCl 10 gLB固体培养基: 取液体培养基500 mL, 加入琼脂粉 7.5g高压灭菌后使用。实验步骤（一）制备含Amp的蓝白斑筛选琼脂平板（以下操作在无菌环境下进行）1. LB固体培养基融化后，待冷却到60 左右，加入氨苄青霉素（工作浓度为100 g/mL），混匀，倒入培养皿中。2. 培养基凝固后，在琼脂平板上加入40L的20 mg/mL的X-Gal和4L的200 mg/

23、mLIPTG溶液，用涂布器（可用乙醇来清洗）涂匀。避光保存3h，以利于IPTG和X-Gal 的吸收。（二）重组子的转化（以下操作在无菌环境下进行）1、 转化（1）感受态细胞的选择TOP 10，TOP10F，DH5，DH5-T1 感受态细胞均可用于质粒的转化。（2）转化平板的制备 向铺好的固体琼脂平板表面加入16 l 50 mg/ml IPTG，40 l 20 mg/ml X-gal，使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37 放置13小时，使溶解Xgal 的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。（3）转化a. 取部分连接产物加到 50100 l 感受态细胞中（感受态细胞应刚从-70冰箱取出放于冰浴上

24、，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一），轻弹混匀，冰浴30 分钟。（必要时请使用超螺旋质粒同时的转化感受态细胞作为对照检测转化效率）b. 将离心管置于42水浴 6090 秒，取出管后立即置于冰浴中放置23分钟，其间不要摇动离心管。c. 向离心管中加入250500 l 37预热的SOC或LB ( 不含抗生素 ) 培养基，180 转，37 振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。d 将离心管内容物混匀，吸取100 l已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的SOB或LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头玻棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温

25、直至液体被吸收，倒置平板，37培养1216小时。涂布用量可根据具体实验来调整。如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200300 l转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心（4,000 rpm, 2分钟）后吸除部分培养液，留下适量的培养基悬浮菌体后将其涂布于一个平板中（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）。阳性对照的操作流程：1. 取200 L甘油保存的感受态细胞，低温融化后，加入1L的空白质粒（DNA 50ng），混匀，冰上放置30 min。2. 将转化的混合物立即放入42 循环水浴中9

26、0sec（注意：不要晃动）3. 然后冰浴2 min。4将200ul的菌液直接涂于阳性对照的平板上结果与讨论：平板培养过夜后应有蓝色和白色的菌落生长, 蓝色菌落较小, 在挑取后进行鉴定没有目的片段被扩增.实验六 质粒DNA的提取【实验目的】 通过本实验学习和掌握质粒DNA的提取方法。【实验原理】 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线形染色体DNA在拓扑学上的差异进行分离的。在PH值为12.0-12.5时，线形染色体DNA的双螺旋结构被解开、变性，但共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍紧密的结合在一起。当加入pH 4.8的乙酸钾使PH值恢复为中性时，共价闭合环状质粒DNA能迅速而准确的

27、复性，而线形染色体DNA由于两条互补链已分开，而不能迅速而准确的复性，而是相互缠绕形成网状结构。因此，通过离心，线形的染色体DNA，不稳定的大分子RNA，以及由SDS变性的蛋白质都一起沉淀下来，被除去。【仪器】 恒温摇床，低温离心机，高压灭菌锅，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱【材料】 含有质粒的大肠杆菌菌液试剂盒提取质粒试剂:1. 0.5 TBE电泳缓冲液2. 6 上样缓冲液3. 琼脂糖4. DNA相对分子量标准物（DNA Marker）5. 溴化乙锭（EB）6.无水乙醇7.离心柱型 质粒小提试剂盒： 20次2溶液P17 mlRNaseA（10 mg/ml）70 l溶液P27 ml溶液P310

28、 ml漂洗液PW15 ml洗脱缓冲液EB15 ml吸附柱CB3 20个收集管（2 ml）20个【实验步骤】试剂盒提取质粒方法1 取15 ml过夜培养的菌液加入离心管中，13,000 rpm (17,900g) 离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。2 向留有菌体沉淀的离心管中加入250 l溶液P1 （请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。3 向离心管中加入250 l溶液P2，温和地上下翻转68次使菌体充分裂解。温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组D

29、NA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟 ，以免质粒受到破坏。4 向离心管中加入350 l溶液P3，立即温和地上下翻转68次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。 13,000 rpm (17,900g) 离心10分钟，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中， 注意尽量不要吸出沉淀。P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。5 将上一步所得上清液加入吸附柱CB3中 （吸附柱放入收集管中），室温放置12分钟，13,000 rpm (17,900g) 离心3060秒，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。6 向吸附柱CB3中

30、加入700 l漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），13,000 rpm (17,900g) 离心3060秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。7 向吸附柱CB3中加入500 l漂洗液PW，13,000 rpm (17,900g) 离心3060秒，弃掉收集管中的废液。8 将吸附柱CB3重新放回收集管中置于13,000 rpm (17,900g) 离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱CB3置于室温或50温箱放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。9 将吸附柱CB3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的

31、中间部位悬空滴加50100 l经65-70水浴预热的洗脱缓冲液EB， 室温放置2分钟， 13,000 rpm (17,900g) 离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。10. 为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，重复步骤9。 11. 用琼脂糖凝胶电泳检测质粒提取的结果。对于大小超过10 kb的质粒在吸附和洗脱时可以适当的延长时间，以增加提取效率。洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20，以防DNA降解。也可用TE

32、buffer (10 mM TrisCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)作为洗脱缓冲液，但EDTA可能会影响后续的测序反应等实验。低拷贝或大质粒（10kb）提取如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，使用510 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，洗脱缓冲液应在 70预热，其它步骤相同。质粒DNA浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。电泳可能为单一条带，也可能为2到3条DNA条带，这主要与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。OD260值为1相当于大约50 g/ml 双链DNA。OD260/O

33、D280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，但并不表示纯度低。因为pH值和离子存在会影响光吸收值。 实验七 克隆子的鉴定【实验目的】利用PCR技术和限制性核酸内切酶法进一步鉴定阳性克隆子一、使用PCR 方法鉴定阳性克隆：pGM-T重组菌落PCR鉴定试剂盒：50次 PCR MasterMix 反应体系介绍:该系统使用方便快捷，能避免PCR操作过程中的污染，使用时只需取适量2PCR MasterMix溶液，加入模板和引物，并加入去离子水补足体积，使MasterMix溶液的浓度为1即可进行反应。1. 使用PCR MasterMix 反应体系, 按照下表加入

34、各种后，将其分装成20 L /管。分别扩增目的片段和对照片段, 使用不同的引物。 Template少许的菌落Primer 1(10 M)1 lPrimer 2(10 M)1 l2Master Mix15 lddH2O补至30 l2. 先在平板的底部为准备鉴定的菌落进行编号。使用灭菌的小吸头或牙签挑取平板上的白色菌落少许（留一部分菌体用于保存菌种），将小吸头或牙签放入同样标号的PCR MasterMix 反应体系中洗下菌体后，弃去小吸头或牙签，将离心管短暂离心后，放入PCR仪中开始反应。反应条件如下： 94 2 min94 30 sec 55 30 sec 35 cycles 72 30 min

35、72 5 min3. 使用琼脂糖凝胶电泳系统检测重组菌鉴定的结果。二、使用限制性核酸内切酶法【材料】DNA:购买或自行提取纯化;重组pGM-T质粒;EcoRI酶及其酶切缓冲液:购买成品;琼脂糖(Agarose):进口或国产的电泳用琼脂糖均可。 【设备】水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,照相支架,照相机及其附件；或凝胶图形分析仪 。【试剂】 1、5TBE电泳缓冲液： 2、6电泳载样缓冲液：0.25溴粉蓝，40(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4。 3、溴化乙锭(E溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即【实验步骤】(

36、一)DNA酶切反应 1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号,用微量移液枪分别加入DNA1g和相应的限制性内切酶反应10缓冲液2l,再加入重蒸水使总体积为19l,将管内溶液混匀后加入1l酶液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。 2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上）,37水浴保温2-3小时,使酶切反应完全。 3、每管加入2l0.1mol/LEDTA(pH8.0),混匀,以停止反应,置于

37、冰箱中保存备用。 (二)DNA分子量标准的制备 (三)琼脂糖凝胶的电泳 1、取5TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成0.5TBE稀释缓冲液,待用。 2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至

38、50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(E溶液使其终浓度为0.5g/ml(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5g/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。 4、加样：取10l酶解液与2l6载样液混匀,用微量移液枪小

39、心加入样品槽中。若DNA含量偏低,则可依上述比例增加上样量,但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时,停止电泳。 6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/ml的EB溶液中,室温下染色20-25分钟。 7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有

40、机玻璃面罩,以免损伤眼睛。经照相机镜头加上近摄镜片和红色滤光片后将相机固定于照相架上，采用全色胶片，光圈5.6,曝光时间10-120秒(根据荧光条带的深浅选择)。 8、DNA分子量标准曲线的制作：在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量DNA的EcoR和Hind酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。 9、DNA酶切片段大小的测定：在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小

41、(若用单对数坐标纸来绘制标准曲线,则可根据迁移距离直接查出DNA片段的大小)。反之,若已知DNA片段的大小亦可由标准曲线上查出它预计的迁移距离。 10、DNA酶切片段排列顺序的确定：根据单酶切,双酶切和多酶切的电泳分析结果,对照DNA酶切片段大小的数据进行逻辑推理,然后确定各酶切片段的排列顺序和各酶切位点的相对位置。以环状图或直线图表示,即成该DNA分子的限制性内切酶图谱。 注意1.酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1mglDNA的酶量为一个单位，但是许多实验制备的DNA

42、不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶活性将受影响。 4、观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm）,以减少紫外光切割DNA。 5、EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容

43、器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。 6、当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。 实验八 SDSPAGE测蛋白质的分子量【实验目的】 通过本实验学习和掌握SDS-PAGE电泳的原理和方法 采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，polyacrylamide gel electrophoresis）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为SDS-PAGE不连续系统。【基本原理】聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（acrylamide）和N,N-亚甲基双丙稀酰胺（N,N-methylene bis acrylami

44、de）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）和过硫酸胺（ammonium persulfate，AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。 不连续系统由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶（pH6.7，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。分离胶（pH8.9，孔径小）通过分子筛效应和电荷效应，把样品中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。 如果要利用凝胶

45、电泳测定某一蛋白质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到可以忽略不计的程度，使蛋白质泳动率的大小完全取决于分子量。如何去除电荷效应呢？现常用的是十二烷基硫酸钠（SDS）。SDS是一种阴离子去污剂。在电泳体系中加入一定浓度的SDS，SDS以一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷的差异。【试剂】Sol A：30%凝胶 丙烯酰胺30g，N,N亚甲基丙烯酰胺0.8g，加水至100ml。棕色瓶4C避光保存。Sol B：分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-Cl, pH8.9） Tris 36.3g，1N

46、 HCl 48ml，补水至200ml。Sol C：浓缩胶缓冲液（1mol/L Tris-Cl, pH6.7） Tris12.1g，1.6N HCl 50ml，补水至100ml。10% SDS10% AP（过硫酸铵，ammonium persulfate）现用现配TEMED（N,N,N,N四甲基乙二胺）（v/v）1% Agar： Agar 0.3g Sol B 7.5ml 10% SDS 0.3ml 水 22.2ml电泳缓冲液： Tris 15g Glycine 72g 10% SDS 50ml 加水至5升（pH8.5）样品缓冲液（2）： 10甘油 2SDS 5b巯基乙醇 20mmol Tris

47、-Cl, pH6.7 0.05%溴酚蓝 棕色瓶4C避光保存。染色液：0.25%(w/v)考马斯亮蓝R-250 考马斯亮蓝R-250 1.25g 50甲醇 450ml 冰醋酸 50ml脱色液： 冰醋酸 75ml 甲醇 50ml 水 875ml异丁醇标准分子量的蛋白质【设备】电泳系统、双向电泳仪、凝胶图像分析仪等【操作方法】1安装垂直板电泳槽 先将长短不等的两块玻璃板洗净，浸泡乙醇中。用前取出晾干，嵌入垂直板胶带模凹槽内。长玻璃板下沿与胶带框底之间保留23mm距离，使此端的凝胶与阳极相通；而短玻璃板的下沿则插入橡胶模的底槽内，三边均密封。 按“夹芯”法将上述凝胶模子装入电泳槽内。注意电极方向，短玻

48、璃板位于阴电极槽一侧（白金电极丝在槽的上方），长玻璃板位于阳极一侧（白金丝在槽的底部）。2 用滴管吸取融化的1%琼脂糖溶液，灌入凝胶模板底部（长玻璃板外侧底部），封住底部的窄缝（通向阳极的盐桥）。3 配胶 根据所测蛋白分子量范围，选择适当的分离胶浓度，按表所列的试剂用量和加样顺序配制胶。表中为30ml分离胶和10ml浓缩胶，可按实际用量来按比例增加或减少上述试剂。 SDS不连续系统不同浓度凝胶配制用量表 分离胶： 7% 10% 12% 20% 3%浓缩胶 Sol A 7 10 12 20 1.0 Sol B 7.5 7.5 7.5 7.5 Sol C 1.25 10%SDS 0.3 0.3 0

49、.3 0.3 0.1 TEMED 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 双蒸水 15 12 10 2 5.55 混匀，抽气去氧 10%AP 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 4 灌注分离胶 一旦加入AP后，轻轻混匀，立即小心地将分离胶灌入准备好的凝胶模子玻璃板间隙中，上端保留3cm高的空隙。用吸管将异丁醇覆盖分离胶液面（压平分离胶面；阻止空气中的氧对凝胶聚合的抑制）。约30分钟聚合完成（形成明显的界面），倒去覆盖液，用1ml Sol C涮洗2次，用吸水纸尽可能地吸干残液。5 灌注浓缩胶 用吸管将浓缩胶加在分离胶上，插入合适的样品孔梳子，避免出现气泡。室温下聚合约30分钟，细心拔出梳子，用双蒸水涮洗样品孔，去除未聚合的丙烯酰胺，用滤纸吸干残液。6 处理样品 将样品（蛋白质浓度以1-1.5mg/ml浓度为宜）与等量样品缓冲液混匀，100C,3分钟。标准分子量蛋白质，按1mg/ml比例溶解，取出适当的标准品加等量的样品缓冲液混匀，煮沸2分钟，取出冷却。将处理好的样品与标准品，以每孔20-50ml（根据样品孔的大小及蛋白质的浓度决定），用微量移液器轻