基因工程操作程序.ppt

1、,EcoR,黏性末端,黏性末端,Go back,Sma,平末端平末端,可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，,Ecoli DNA连接酶或T4DNA连接酶,即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低,T4DNA连接酶,1.2基因工程的基本操作程序,提问:基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？,提取目的基因， 目的基因与运载体结合， 将目的基因导入受体细胞， 目的基因的表达和检测,一、目的基因的获取,1、目的基因： 主要指的是 的结构基因，也可以是一些具有 的因子. 2、获取方法： （1）、从基因文库中获取目的基因。 （2）、

2、利用PCR技术扩增目的基因 （3）、人工合成,编码蛋白质,调控作用,1. 什么叫做基因文库？ 2基因文库的种类？,思考？,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,（1）从基因文库中获取目的基因,基因组文库与部分基因文库的关系,下列关于基因文库的说法错误的是 A. 可分为基因组文库和部分基因文库 B.cDNA文库属于部分基因文库 C.基因组文库的基因在不同物种之间 均可进行基因交流 D. 同种生物的cDNA文库基因数量较基 因组文库基因数量少,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：基因的核苷酸

3、序列 基因的功能 基因的位置 基因的转录产物 基因的翻译产物等特性,（2）利用PCR技术扩增目的基因 （3）化学法直接合成目的基因,完成学案有关习题,针对基因较小，核苷酸序列已知，可以人工合成,已知其序列 已知其mRNA 的序列（必二P68 ） 已知其翻译产物的氨基酸序列（选三P26）,适用 范围,PCR技术扩增,人工合成,变性,复性,延伸,二、基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的

4、过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,1、由以上过程推知,作为目的基因的运载体应具备的结构是 。 2、基因表达载体的构建过程是在 （细胞内、细胞外）进行，需要的工具有 。 3、请绘出一个基因表达载体的模式图？,回答问题,目的基因、启动子、终止子、标记基因等,细胞外,限制酶和DN

5、A连接酶,基因表达载体的构建,1、基因表达载体的组成,复制原点 目的基因 启动子 终止子 标记基因等,1.将目的基因与载体混合并用DNA连接酶处理后，会出现几种结果？ 2.怎样从中帅选出所需要的重组质粒？,思考？,三种：1、目的基因与载体结合 2、目的基因与目的基因结合 3、载体与载体结合,利用质粒中含有的一些标记基因如抗生素基因等所赋予的重组质粒的特性进行筛选,完成导学案习题,总结一下这节课学习的内容,提问:基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？,提取目的基因， 目的基因与运载体结合， 将目的基因导入受体细胞， 目的基因的表达和检测,三、将目的基因导入受体细胞,转化,Ca2+处理法,显微

6、注射法,农杆菌转化法、 基因枪法、花粉管通道法,微生物细胞,动物细胞,植物细胞,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物,请分析农杆菌不能感染单子叶植物的原因？,农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些酚类物质吸引农杆菌向受伤组织集中；研究表明这种物质是在双子叶植物的细胞壁中合成的，通常不存在于单子叶植物中，因此农杆菌不能侵染单子叶植物。,转化,采用基因工程的方法培育抗虫棉,下列导入目的基因的做法正确的是（ ） 将毒素蛋白注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该菌感染棉的体细胞，再进行组织培养 将编码毒素蛋白的D

7、NA序列，与质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵 A. B. C. D.,C,操作程序： 将含有目的基因的表达载体 获得 显微注射胚胎 胚胎 发育成具有新性状的动物,2、导入动物细胞,显微注射法,提纯,保存备用,受精卵,培养,移植,受精卵能否由动物体细胞代替？为什么采用受精卵？,不能，动物体细胞的全能型受限制。采用受精卵是因为受精卵全能型高，并且营养物质丰富，细胞较大易操作,2.原核生物作受体细胞原因：,3、将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞细胞表达载体与感受态细胞混合 _细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：

8、,Ca2+处理法,四、目的基因的检测与鉴定,为什么要有这一步骤？,目的基因是否 进入受体细胞,目的基因是否 转录出mRNA,目的基因是否 翻译出蛋白质,DNA分子杂交 DNA-DNA,分子杂交技术 DNA-RNA,抗原-抗体杂交,是否成功显 示出杂交带,同上,同上,包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性程度；基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能活性是否相同。,完成导学案习题,总结一下这节课学习的内容,1.下表关于基因工程中有关基因操作 的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中

9、提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因， 该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,5.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注

10、射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,1、导入植物细胞常用的方法是什么？具体过程是怎样的？ 2、导入动物细胞常用的方法是什么？基本操作程序是怎样的？ 3、导入大肠杆菌的方法是怎样的？钙离子有什么作用？,哪些细胞可以作为目的基因的受体？,1、导入到植物细胞常用的方法有农杆菌感染法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）和花粉通道法 2、导入到动物细胞常用的方法是显微注射法（先提纯目的基因，再体外注射入卵细胞或受精卵中，最后将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体。 3、导入到大肠杆菌（原因？）时先用Ca2+处理成感受态后与溶有载体DNA的缓冲液混合,吸收DNA分子,完成转化

11、,四、目的基因的检测与鉴定,导入目的基因后需要检测哪些方面？各采取什么方法？ 什么是DNA分子探针？检测时的DNA探针通过什么原理来检测目的基因和相应的mRNA？ 利用抗体抗原杂交检测的原理是什么？,四、目的基因的检测与鉴定,1、分子水平的检测：分子杂交技术 2、个体生物学水平的签定,建立基因文库,（1）从基因文库中获取目的基因,、基因文库 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,PCR技术原理 及反应过程,原理： DNA双链复制,反应过程：,1加热至9095 目的基因DNA解链 2冷却至5560 ， 引物结合到互补D

12、NA链 3加热至7075 ， 热稳定DNA聚合酶从 从引物起始互补链的 合成,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,(二)基因表达载体的构建,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,基因文库的构建模式图,通过对受体菌的培养而储存基因,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,总结：表达载体需由哪几部分组成,复制原点 启动子 目的基因 终止子 标记基因,它们的作