细胞生物学植物组织培养实验方案

1、细胞学实验中的植物组织培养参考文献1.实验目的：1.学习和制备植物组织质谱固体培养基；2.学习和使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌；3.理解和掌握无菌操作；4.将胡萝卜贮藏组织培养成胡萝卜苗。二、实验原理：细胞全能性：植物中的每一个细胞都携带着完整的基因组，并有可能发育成完整的植物。在人工预测的控制下，将植物的任何细胞、组织和器官置于含有营养物质和生长调节剂的培养基中，使其生长、分化并形成完整植物的过程称为植物组织培养。三、实验设备：1.实验材料：新鲜优质的胡萝卜肉质根。2.实验设备(1)仪器设备：冰箱、通用天平、分析天平、各种类型的试剂瓶(棕色和白色)、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、搪瓷杯、药勺、称重

2、纸、玻璃棒、标签纸、电磁炉、三角瓶、医用杯、精密酸碱度试纸(pH5.47.0)、药勺、密封膜、牛皮纸等。主要仪器设备有灭菌锅、洁净工作台、恒温培养箱等。(2)药物硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、肌醇、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(-萘乙酸)、6-BA(6-苄基腺嘌呤)、KT、浓盐酸、氢氧化钠、浓硫酸、重铬酸钾、95%乙醇、蒸馏水、质谱培养母液的化学成分MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1毫升盐酸、1毫升氢氧化钠、愈伤组织继代培养基和75%乙

3、醇。Iv .实验步骤：整个实验过程：质谱培养基母液的制备和保存胡萝卜愈伤组织器官分化培养胡萝卜肉质根愈伤组织诱导培养(接种和原代培养)质谱固体培养基的制备胡萝卜愈伤组织的继代培养胡萝卜愈伤组织培养取样和消毒培养基和接种设备的灭菌胡萝卜育苗1.1母液的制备和保存。质谱培养基(1)母液的制备：母液是待制备的培养基的浓缩液，其浓度通常比所需浓度高10-100倍。1、大元素质谱母液(10)称取10升，溶于1升蒸馏水中。加入1升培养基，取100毫升母液。化学的1升数量10升(10)数量为50升(50)NH4NO31650毫克16.5克KNO31900毫克19.0克氯化钙(氯化钙)440毫克()4.4g硫

4、酸镁(硫酸镁)370毫克()3.7克KH2PO4170毫克1.7g2.质谱微量元素母液(100)按10升溶于100毫升蒸馏水中。加入1升培养基，取10毫升母液。化学的1升数量10升的数量数量为100升(100)硫酸锰(硫酸锰)22.3毫克(21.4毫克)223毫克(214毫克)ZnSO47H2O8.6毫克86毫克H3BO36.2毫克62毫克基里巴斯0.83毫克8.3毫克Na2MoO42H2O0.25毫克2.5毫克硫酸铜45H2O0.025毫克0.25毫克氯化钴6H2O0.025毫克0.25毫克注意：氯化钴6H2O和硫酸铜45H2O可称量10次(0.25 mg10=2.5毫克)或100次(25毫

5、克)，然后放入100毫升水中，每次10毫升或1毫升，即0.25毫克.3.质谱铁盐母液(100)按10升溶于100毫升蒸馏水中。加入1升培养基，取10毫升母液。化学的1升数量10升的数量数量为100升(100)Na2EDTA37.3毫克373毫克FeSO47H2O27.8毫克278毫克注意制备，这两种成分都溶于少量的蒸馏水中，其中EDTA盐很难完全溶解，可以适当加热。混合时，将其中一种成分放入容量瓶(烧杯)中，然后加入另一种成分并剧烈摇动，直到产生深黄色溶液。最后，固定体积并将其储存在棕色试剂瓶中。4.质谱有机母液(100)按10升溶于100毫升蒸馏水中。加入1升培养基，取10毫升母液。化学的1

6、升数量10升的数量数量为100升(100)烟酸0.5毫克5毫克盐酸吡哆醇(VB6)0.5毫克5毫克盐酸硫胺素(VB1)0.4毫克4毫克肌糖100毫克1 g甘氨酸2 . 0毫克20毫克5.生长调节剂单独制备，浓度为1-5毫克/毫升(在本书中为0.5-1毫克/毫升)，本实验要求1毫克/毫升。制备培养基母液时的注意事项：(1)有些离子容易沉淀，可先溶于少量水中，然后按配方顺序混合；(2)制备母液时使用蒸馏水或再蒸馏水；药物应该是化学纯的或分析纯的；生长素溶解后，可用少量0.1-1 N氢氧化钠或95%乙醇溶解，溶解的有丝分裂原可用0.1-1 N盐酸加热溶解(如果加入蒸馏水，容易出现白色沉淀，此时可加入

7、热水)。(2)母液的保存1.装瓶：将配制好的母液放入试剂瓶，贴上标签，注明每种培养基的母液名称、浓缩次数、日期和配制者。(注意把那些容易分解和氧化成棕色的瓶子)例如：MS铁盐(100)2.储存：4冰箱。(3)注意事项1.6-ba，NAA剂量很小，服用时使用移液管，移液管越小，越准确。2.制备大量元素母液时，注意防止钙盐、硫酸盐和磷酸盐沉淀；3.铁盐母液应储存在棕色瓶中。注意酸碱度的调节；2.准备2。质谱固体培养基1升固体质谱培养基制备：(1)用量筒从各种母液中取出所需量：常量元素的质谱母液100毫升，微量元素的质谱母液10毫升，铁盐的质谱母液10毫升，有机物的质谱母液10毫升。(2)用电子天平

8、称取8克琼脂粉和30克蔗糖，放入烧杯中，加入少量蒸馏水，在微波炉中加热溶解。(3)用移液管，取适量6-BA和NAA，放入组织培养瓶中。各种类型的媒体：培养基：MS0，即：毫升，30克/升蔗糖，8克/升琼脂粉；有两种愈伤组织诱导培养基，即ms00.1 mg/l 2，4-d和ms02 mg/l 2，4-d 0.2 mg/l 6-ba(后者用于本实验)。(4)最后，将体积定为1L；用蒸馏水；用1摩尔/升氢氧化钠或1摩尔/升盐酸溶液调节培养基的酸碱度至5.8 6.0。(5)尽快包装，介质占容器的1/5-1/4(20-25毫升)，尽量避免介质粘在容器内壁或容器口，并注明日期。(6)用橡皮筋和牛皮纸密封。

9、3.培养基和接种设备的灭菌1.清洗：彻底清洗玻璃器皿，如培养皿、三角瓶、试管和组织培养基烧杯(根据实际需要)。自然干燥或在烤箱中干燥。2.捆扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡纸包裹玻璃器皿和金属器具。3.无菌水：将400毫升蒸馏水装入两个500毫升锥形瓶中，用牛皮纸密封。4.注水：向高压釜中注入一定量的水(水应淹没电热丝)。(不要烧干！(5.装载物品：将装有培养基的培养瓶或三角瓶、装有蒸馏水的锥形瓶、包装好的玻璃器皿和金属器具放入灭菌锅内。6.灭菌：打开排气阀加热，直到锅内释放出大量水蒸气(此时水蒸气水平喷射)，然后关闭阀门；或者当锅内压力升至49.0千帕时，打开排气阀，排出锅内所有冷空气。当锅内压

10、力达到108千帕，温度达到121时，15-20分钟即可灭菌。(如果灭菌时间太长，培养基中的某些成分将变性并失效。)切断电源，让灭菌锅冷却3.包装应干净，灭菌时锥形瓶应尽量放直，以免培养基流出；4.如果灭菌时间过长，培养基中的某些成分会变性而失效；5.打开盖子后，尽快转移培养瓶，以冷却和固化培养瓶。一般来说，无菌培养瓶应储存在室内30以下，最好在4-10。4.愈伤组织诱导培养接种环境1.首先用75%酒精擦拭超净桌子的六个内表面。2.放置现有的操作工具，如75%酒精、0.1%氯化汞溶液、刀具、镊子、无菌纸、无菌水、小烧杯、培养皿、废液罐、试管架、打火机等。在相应的位置。3.向酒精灯中加入适当的酒精

11、(不超过体积的2/3)，并检查其是否可以点燃。4.先打开紫外线灯40分钟，然后通风20分钟。5、进入工作站的物品都用酒精消毒。接木1.在无菌操作台上操作。2.点燃酒精灯，倒入平板。3.外植体消毒：将清洗干净的胡萝卜根放入无菌手术台。胡萝卜根用70%酒精消毒5分钟，然后用0.1%氯化汞溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗3次，放入装有无菌水的烧杯中备用。4.拆下镊子，把它们放在浸有工业酒精的瓶子里。使用时，在酒精灯的火焰上燃烧消毒。5.切外植体：用无菌刀将外植体沿切面切成约3 5毫米厚的小盘，然后如图所示切下，切掉韧皮部和木质部，留下形成层。6.接种外植体，4 5/培养皿：打开牛皮纸时，三角瓶的瓶口应

12、倾斜并靠近酒精灯的火焰。接种时，要求将其置于悬浮液中，不要接触三角瓶内壁，胡萝卜应放在培养基上。开封密封时，可以将三角形瓶口放在火焰上燃烧。7.用橡皮筋和牛皮纸密封。8.附上标签纸。注意事项：1.在接种过程中，手不能接触外植体；2.每次接种前对接种工具进行消毒；3.你可以给你的对手消毒很多次；4.实验废液不能随意处理，需要专门收集和处理。5.胡萝卜愈伤组织的继代培养1.胡萝卜细胞悬浮培养基的制备(1)配方：MS基础培养基2.0毫克/升naa0.1mg毫克/升6-ba 200毫克/升水解酪蛋白3%蔗糖(2)制备过程：(与胡萝卜愈伤组织诱导培养基的制备相同)。2.准备工作接种室的清洁和消毒；洁净工

13、作台的启动和消毒；准备剪刀、镊子、无菌培养皿、滤纸和备用培养基；材料准备(选择一个装有已分化出愈伤组织的无污染外植体的三角烧瓶，并将其放在干净的工作台上)3.愈伤组织继代培养将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染外植体产生的愈伤组织剥离并转移到愈伤组织继代培养基中，在25黑暗条件下培养愈伤组织，在摇床上振荡培养分离单细胞。已经获得足够的愈伤组织作为后续实验的实验材料。6.愈伤组织器官分化培养(1)准备工作(1)接种室的清洁和消毒；洁净工作台的启动和消毒；准备要使用的剪刀、镊子、无菌培养皿、滤纸和培养基；(4)实验材料的制备(选择一个含有无污染的已分化愈伤组织外植体的三角瓶，放在干净的工作台上

14、)；在无菌条件下，用镊子夹住胡萝卜肉质根的愈伤组织，放入培养皿中，培养皿底部放有无菌滤纸，用手术刀挑取愈伤组织生长活跃的部分进行接种。(2)选择黄色、疏松、健壮的愈伤组织，接种在分化培养基上，在25下以14小时 10小时的光暗比培养约30天，诱导不定芽。(3)配方：质谱基本培养基0.1毫克/升NAA 1毫克/升6-BA 0.7%琼脂3%蔗糖(制备方法同上)。7.胡萝卜育苗当生根的植物形成一定数量的根并长到6 7片叶子时，幼苗变硬。炼苗约7天后，打开瓶盖，在超净台上拔出，用无菌水轻轻冲洗，去除根系上的培养基，然后移入盛有土壤的锅中，进行常规栽培管理。5.实验结果2015.10.212015.11.23胡萝卜愈伤组织培养中的胡萝卜植物组织培养；2015.11.232015.12。胡萝卜愈伤组织分化培养在胡萝卜植株组织培养中的应用：实验图片：2015.10.21 2015.11.02 2015.11.