实验三1.4发育.ppt

1、实验三、小鼠胚胎的采集及 其形态观察,胚胎的采集是胚胎工程和动物发育生物学领域的一项基本技术。通过本实验内容，为进一步开展胚胎的体外培养、胚胎移植、胚胎的性别鉴定、胚胎分割等技术打下基础； 通过本实验学习，掌握小鼠不同时期受精卵的采集方法及不同时期胚胎的形态特征；,一、目的与意义,哺乳动物卵由卵巢释放进入输卵管，在壶腹部受精并完成第二次减数分裂，开始缓慢的卵裂，通常1224h完成一次，最初的几次卵裂是在输卵管完成，因此可以利用输卵管冲卵法获得28细胞期胚胎； 卵裂的胚胎借助输卵管纤毛运动朝子宫方向迁移，大约在受精卵发育后第三天（桑椹胚阶段）移行到子宫，并在子宫发育至囊胚后着床，因此子宫冲胚法适

2、用于桑椹胚和囊胚的获得。,二、实验原理,哺乳动物旋转均裂（全卵裂）（海胆与家兔比较）,细胞紧密化（compaction）,（小鼠8细胞胚胎紧密化现象前后比较）,胚胎的早期发育过程,三、实验仪器与试剂药品,1.仪器：实体显微镜、倒置显微镜、冲卵器、培养皿、滤纸、纱布、钟表镊、眼科剪、注射器、酒精棉等 2.药品试剂：超排药物（PMSG和HCG）、PB1液、M16液、液体石蜡 3.实验动物：性成熟的雄性和雌性小鼠,1.实验动物的准备 超排卵处理：选择性成熟的雌性小鼠，间隔48h依次腹腔内注射各10单位PMSG和hCG； 交配：在上述进行hCG处理的同时，与性成熟的雄性小鼠合笼交配，在第二天，雌性小鼠

3、的阴道口见有阴道栓者判定为交配成功。用于下列实验。,四、实验步骤,将上述经过超排和交配过的雌性小鼠，在处理hCG后的38-48h，剖腹采取输卵管及与之相连的子宫和卵巢，并置于铺有灭菌滤纸的操作盘内。,2.输卵管胚胎的采集,通过输卵管可以采集28细胞期的胚胎。本实验主要介绍2-细胞期采集的方法。,输卵管灌流 在实体显微镜下，用带有27-30G注射针的注射器，通过输卵管腹腔口(伞部）或宫管连接部口，利用PB1溶液灌流输卵管，,在实体显微镜下，观察灌流输卵管的灌流液，查找2-细胞期胚胎，将收集到2-细胞期胚胎用PB1溶液清洗23次后。移到盖有液体石蜡的培养皿内的液滴中； 在实体显微镜下，观察收集到的

4、2-细胞期胚胎形态，主要观察透明带、卵裂球的大小、极体及异常胚胎等。,2细胞期胚胎的收集及其观察,通过子宫灌流可以获得桑椹胚、囊胚和孵化囊胚，本实验主要介绍桑椹胚和囊胚的采集方法。,将上述经过超排和交配过的雌性小鼠，在处理hCG后的96120h，剖腹采取输卵管及与之相连的子宫和卵巢，并置于铺有灭菌滤纸的操作盘内。,3.子宫内胚胎的采集,用眼科剪等仔细去掉子宫周围的脂肪，在切断输卵管的同时，切断子宫角和子宫体的连接部，使双侧子宫角分离为二，置于含有培养液的表面皿中,子宫灌流 准备含有操作液的1ml一次性注射器。用注射针，将上述处理后的单侧子宫角的宫管连接部的子宫端刺破，然后用注射器由子宫颈端向输卵管端灌流，灌流量约051.0ml。,胚胎收集及观察 在实体显微镜下，查找桑椹胚和囊胚。用移卵管将观察到胚胎，用PB1溶液清洗23次后，将其收集到盖有液体石蜡的培养皿内的液滴中； 在实体显微镜（90100倍）下，观察桑椹胚和囊胚的形态，主要观察胚胎发育期的一致性，细胞的紧密、死亡细胞数、胚胎的亮度、透明带是否损伤等。,1.掌握小鼠胚胎