PCR引物设计.ppt

1、PCR引物设计,演讲：叶丽娜 李昆 余恩超 潘美慧,引物的概念及类型：,引物概念：引物指的是一小段单链DNA或RNA，作为 DNA复制的起始点。 引物类型： RNA引物存在于自然界中生物DNA的复制引物。 DNA引物聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物。,所有的DNA复制都是从一个固定的起始点开始的。而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能够从头合成DNA。因此体外扩增DNA时要以一小段DNA引物作为复制的起始点。 RNA聚合酶能够从头合成RNA，因此自然界中生物DNA的复制以RNA引物作为复制的起始点。,引物设计的目的,引物设计的目的,PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸序

2、列，使其能有效的扩增模板DNA链。,下游引物 5GAACTTT3 P2 5GGATCTAGCGTAGCTTGAAA3 正义链 3CCTAGATCGCATCGAACTTT5 P1 5GGATCTA3 上游引物 P1：5-GGATCTA-3 P2：3-TTTCAAG-5,引物与模板结合示意图,PCR原理示意图,引物设计基本原则,引物应在核酸序列保守区内设计并具有特异性。 引物长度一般在1530bp之间，常用1827bp。 G+C含量在40%60%之间。上下游引物GC含量不应相差太大，以有利于退火温度的选择。引物Tm =4（G + C）+2（A + T），退火温度一般比设定的引物 Tm低5。,碱基要

3、随机分布。不要有聚嘧啶或聚嘌呤存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C。 引物自身不能有连续4个碱基的互补。以免形成发夹结构。尤其要避免引物3端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。,引物之间不能有连续4个碱基的互补。尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。 G值（自由能）：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。G值（绝对值）越大，则双链越稳定。,引物3端不可修饰,因引物的延伸是从3端开始的。 引物5端可以修饰。,引物的其他类型,1、通用引物： （1）细菌通用引物： 细菌的16s rRNA存在于所有细菌的基因组中，且16s rRNA具有高度的保守性

4、和特异性。针对16s rRNA可设计出鉴定细菌的通用引物。 常用的16s rRNA通用引物为： 27F：5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1492R：5 TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3,引物的其他类型,（2）测序通用引物： 如M13通用引物，以M13噬菌体作为载体，将目的基因连接到载体上，再以M13引物扩增载体，对目的基因进行测序。 M13通用引物序列：(53) M13R：CAG GAA ACA GCT ATG ACC M13F：TGT AAA ACG ACG GCC AGT,Two primers complementarity. Max complemen

5、tarity in continuous: 3 bp, free energy= 1.50 Kcal/mol 5-CGAGAACTTTACCGCCACG-3 | | | 3-GACCCGAGGAAGCACTACT -5 Max complementarity in discontinuous: 7 bp 5-CGAGAACTTTACCGCCACG-3 | | | | | | | 3-GACCCGAGGAAGCACTACT -5,Two primers complementarity. Max complementarity in continuous: 5 bp, free energy=-2.60 Kcal/mol 5-TTTTGGGTTTGGACTGTGCC-3 | | | | | 3-CACCACGCCAAAACTGAAGT-5 Max complementarity in discont