2微生物发酵产酶ppt课件.ppt

1、Chapter 2 微生物发酵产酶 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism,1,Contents of chapter 2,2.4、酶的生物合成及调节,2.1、产酶微生物,2.2、酶的发酵工艺条件及控制,2.3、酶生产过程的动力学,2,动物、植物生产酶制剂的缺陷：,植物由于生长地域、季节、气候等的影响，生产酶制剂的产量、质量都不稳定。 动物产生的酶主要从屠宰牲畜的腺体中提取，来源有限。,2.1.1 产酶微生物的概述,3,4,5,极端环境微生物,嗜冷菌,嗜酸菌,嗜盐菌,6,7,产酶微生物的基本要求,不是致病菌，不产生毒素

2、及有害物质； 发酵周期短，生产成本低，产酶量高； 遗传性稳定，不易变异退化，不感染噬菌体； 最好是产生胞外酶的菌种，利于分离纯化； 对医药和食品用酶，还应考虑安全性； 基因工程菌必须符合安全性要求。,8,酶制剂安全检查指标,9,2.1.2 常见产酶微生物,10,(1) 大肠杆菌,大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。 大肠杆菌的优势主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。,应用： 大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌； 大多数是胞内酶，需进行细胞破碎； 工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等。 DNA聚合酶、连接酶、限制性内切

3、酶等。,11,(2) 醋酸杆菌（Acetobacter）,菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。 应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆 )山梨糖 (维C中间体）。,12,(3)枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.51.51.8m。 枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷、碱性磷酸酶。,13,(4)链霉菌(actinomycetes),应用： 生产葡萄糖异构酶； 青霉素酰化酶

4、、纤维素酶、 几丁质酶等。,14,(5) 根霉(Rhizopus),分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。 代表种：米根霉（R.oryzae)、 黑根霉(R.nigrican)等。 应用： 产生如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸延胡索酸等有机酸。,15,(6)曲霉(Aspergillus),分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。 分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。 代表种：黑曲霉Asp. Niger、黄曲霉Asp.flavus 应用：是制酱、酿酒、

5、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。,16,应用： 啤酒、酒类生产； 生产转化酶、 丙酮酸脱羧酶、 醇脱氢酶等。,(7) 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),17,蛋白酶：59% 糖化酶：13% 淀粉酶：5% 葡萄糖异构酶：6% 果胶酶：3% 纤维素酶：1% 脂肪酶：3% 医药与分析研究用酶：10%,不同类型工业酶的比例,18,调查研究及查阅资料 设计试验方案 确定采集样 品的生态环境 平板分离 确定特殊的培养基及可 能的定性或半定量快速检出法 原种斜面 确定发酵 培养基础条件

6、初筛 复筛 再复筛 菌株 生产性试验 符合工业生产要求 单株纯种分离 毒性试验 符合安全性要求 生产 菌种鉴定 菌种保藏,2.1.3 产酶微生物的分离与筛选,19,（1）含菌样品采集,相近菌种产生的酶性质相近； 胞外酶的稳定性和最适条件与菌的最适生长条件接近； 获得能降解某物质的产酶菌，可从该物质分布丰富的地方寻找。,20,（2）菌的分离纯化 平板划线 稀释分离,（3）产酶性能测定 初筛：选出含有目的酶的菌株，平板培养透明圈法； 复筛：选出产酶量高、性能更符合要求的菌株。,21,（4）菌种的退化与复壮变异和退化保存和培养条件纯种分离,（5）活化与扩大培养 菌种斜面活化逐级放大培养 种子：培养基

7、、条件、种龄、接种量、质量检测、 异常情况,22,2.1.4 产酶微生物优良菌种的选育,诱变育种 原生质体融合育种 基因工程育种,基因洗牌法（gene shuffling） 定向进化（directed evolution）,23,输入参数 底物物理条件,输出参数 细胞组成物质 副产品,代谢过程流程,24,2.2 酶的发酵工艺条件与控制,2.2.2 发酵罐及培养基,2.2.3 发酵条件及控制,2.2.4 提高产酶的措施,2.2.1 发酵生产的优势,25,发酵方法,1、固体培养发酵设备简单、污染少、霉菌 2、液体深层发酵纯度高、易控制条件、 机械强度高、利用率高 3、分批发酵 4、连续发酵 5、补

8、料分批发酵,2.2.1,26,微生物发酵生产法的优点,酶的品种齐全 酶的产量高 生产成本低 便于提高酶制品获得率,2.2.1,27,保藏细胞,细胞活化,细胞扩大培养,发酵,分离纯化,酶,固定化细胞,原生质体,固定化原生质体,培养基,预培养,无菌空气,微生物发酵产酶的工艺流程,2.2.1,28,发酵灌的类型： 传统的、自吸式、气生式、内外循环等,2.2.2,29,培养基,各种生物对营养的需求,2.2.2,30,五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水,培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础。,培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。,任何培养基

9、都应该具备微生物生长所需要五大营养要素,2.2.2,31,1、选择适宜的营养物质 2、营养物的浓度及配比合适 3、物理、化学条件适宜 4、经济节约 5、精心设计、试验比较,培养不同的微生物必须采用不同的培养条件； 培养目的不同，原料的选择和配比不同； 不同阶段，培养条件也有所差异。,培养基的设计原则,2.2.2,32,常用碳源：糖类、醇类、脂类、有机酸、烃类、蛋白质及其降解物；,水是微生物最基本的组成分（）； 水是微生物体内和体外的溶剂（吸收营养成分和代谢废物）； 水是细胞质组分，直接参与各种代谢活动； 调节细胞温度和保持环境温度的稳定（比热高，传热快）。,水,碳源,大多数产酶微生物以淀粉或其

10、水解物为碳源；异养微生物：糖类是最好碳源（葡萄糖最为通用）。,碳源对酶合成的生物调节：阻遏、诱导。,33,构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源 ）,氮源,有机氮源,蛋白胨、酵母膏、牛肉膏,无机氮源,铵盐、硝酸盐,参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性 维持细胞结构的稳定性 调节细胞渗透压 控制细胞的氧化还原电位 有时可作某些微生物生长的能源物质,常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。,氮源,无机盐,需要注意合适的碳氮比,34,生长因子,生长因子是指某些微生物不能用普通的碳源、氮源物质进行合成，而必须另外加入少量的生长需求的有机物质。,分类： 化学结构分成维

11、生素、氨基酸、嘌呤（或嘧啶）及其衍生物和类脂成分 等四类,功能：以辅酶与辅基的形式参与代谢中的酶促反应,实验室中常用酵母膏、蛋白胨、牛肉膏等作为各种生长因子的的需要，麦芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子,35,实验室的常用培养基 细 菌: 牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基） 放线菌：高氏1号合成培养基培养； 酵母菌：麦芽汁培养基； 霉 菌：查氏合成培养基.,36,枯草杆菌BF7658-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%，豆饼粉4%，磷酸氢二钠0.8%，硫酸铵0.4%，氯化钙0.2%，氯化按0.15%（自然pH）。 枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶发酵培养基：玉米粉4%，豆饼粉3%

12、，麸皮3.2%,糠1%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%（自然pH）。 黑曲霉糖化酶发酵培养基：玉米粉10%，豆饼粉4%，麸皮1%（pH4.45.0）。 地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶发酵培养基：玉米粉5.5%, 豆饼4%, 磷酸氢二钠0.4%, 磷酸二氢钾0.03%(pH 8.5)。 黑曲霉AS 3.350酸性蛋白酶发酵培养基: 玉米粉6%, 豆饼粉4%, 玉米浆0.6%, 氯化钙0.5%, 氯化铵1%, 磷酸氢二钠0.2% (pH 5.5)。 游动放线菌葡萄糖异构酶发酵培养基：糖蜜2%，豆饼粉2%，磷酸氢二钠0。1%，硫酸镁0。05% (pH 7.2)。 桔青霉磷酸二酯酶发酵培

13、养基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%, 硫酸镁0.05%, 氯化钙0.04%, 磷酸氢二钠0.05%, 磷酸二氢钾0.05% (自然pH)。 黑曲霉AS3.396果胶酶发酵培养基: 麸皮5%, 果胶0.3%, 硫酸铵2%, 磷酸二氢钾0.25%, 硫酸镁0.05%, 硝酸钠0.02%, 硫酸亚铁0.001% (自然pH)。 枯草杆菌AS1.398碱性磷酸酶发酵培养基: 葡萄糖0.4%, 乳蛋白水解物0.1%, 硫酸铵1%, 氯化钾0.1%, 氯化钙0.1mmol/L, 氯化镁1.0mmol/L, 磷酸氢二钠20mol/L ( 用pH7.4的Tris-HCl缓冲液配制),37,2.2.3 发酵条

14、件及控制,不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物要求不同pH的培养基。,通常培养条件： 细菌与放线菌：pH6.5-8.0 酵母菌和霉菌：pH4.5-6,（1）pH值对产酶的影响与调节控制,细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。,有些细胞可以同时产生若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的pH值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。,38,维持培养基pH的方法： 通常在培养基中加入pH缓冲剂； 在进行工业发酵时补加酸、碱； 最成功的是补料： 稳定pH、 解除产物的阻遏作用、 补充营养物质。 （NH4）2SO4/氨水,39

15、,通常在生物学范围内每升高10，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。,（2）温度的影响与调控,有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定性，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。,枯草杆菌的最适生长温度为3437,黑曲霉的最适生长温度为2832 ,40,调节温度的方法：,热水升温 冷水降温,热交换装置：排管、蛇管、喷淋管等。 随时准备冷、热水。,41,（3）溶解氧的控制,在酶的发酵生产过程中， 处于不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强

16、度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供给适量的溶解氧。临界氧浓度,培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。,调节通气量 调节氧的分压 调节气液接触时间 调节气液接触面积 改变培养液的性质,控制溶解氧方法,42,（4）泡沫的影响 阻碍二氧化碳排除、影响氧溶解、发酵液外溢、限制装料量 选不易产泡沫的菌种、调节培养基成分

17、、机械消泡或化学消泡 （5）湿度的影响 培养前期降低湿度，培养后期增加湿度。,43,2.2.4 提高酶产量的措施,（1）添加诱导物,对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。,诱导物一般可以分为3类 酶的作用底物 酶的催化反应产物 作用底物的类似物,44,（2）控制阻遏物的浓度,为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源的浓度。,采用其他较难利用的碳源，如淀粉等,采用补料、分次流加碳源,添加一定量的环腺苷酸（cAMP）,对于

18、受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。,45,（3）添加表面活性剂,表面活性剂可以与细胞膜相互作用，增加细胞的透过性，有利于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。,将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增加。,由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，尤其是季胺型表面活性剂（如新洁而灭等）是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。,（4）添加产酶促进剂,产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷

19、酸二酯酶的产量提高120倍；添加聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol）可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过试验确定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。,46,微生物发酵生产法中尚待解决的问题,消除毒性 优良产酶菌种的筛选、培育,回本节,47,2.3 酶生产过程的动力学,2.3.1 酶生物合成的模式,2.3.2 酶生产过程中细胞生长动力学,2.3.3 酶生产过程中产酶动力学,48,2.3.1 酶生物合成的模式,通过分析比较细胞生长与酶产生的关系, 可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。

20、,49,同步合成型（生长偶联型）,酶的生物合成与细胞生长同步进行。大部分组成酶、部分诱导酶按照此种模式进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanase EC3.1.1.20）。,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,50,延续合成型,酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。 例如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。

21、,酶 浓度 U/ml,细胞 浓度 mg/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖的果胶为诱导物,51,中期合成型,该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。 例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1) 。,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,52,滞后合成型（非生长偶联型）,在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合 成并大量积累。如许多水解酶。主要原因是由于受到培养 基中存在的阻遏物的阻遏作用。若培养基中不存在阻遏 物，该酶的合成可以转为延续合成型。 该类型酶所对应的mRNA稳定性

22、很好，可以在细胞生长进入 平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。,黑曲霉羧基蛋白酶生物合成,放线菌素D 对产酶的影响,细胞 浓度 mg/ml,酶 浓度 U/ml,酶 浓度 U/ml,酶 浓度 U/ml,30,22,不加,加入,不加,加入,回本节,53,2.3.2 酶生产过程中细胞生长动力学,细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。,在培养过程中， 细胞生长速率与细胞浓度成正比,假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，

23、为这种限制性基质浓度的函数。,KS 为莫诺德常数， 是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。,54,回本节,限制性基质的物料平衡式,莫诺德方程是基本的细胞生长动力学方程。在发酵过程优化以及发酵过程控制方面具有重要的应用价值。不少学者从不同的情况出发或运用不同的方法，对莫诺德方程进行了修正，得出了适用于不同情况的各种动力学模型。,连续培养时的方程变化形式,55,2.3.3 产酶动力学,产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。 产酶动力学的研究可以从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率及其影响因素，这称为宏观产酶动力学或这称为非结构动力学。 也可以从

24、细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率及其影响因素，这谓之微观产酶动力学或称为结构动力学。,56,在酶的发酵生产中，酶的产量高低，是发酵系统中群体细胞产酶的集中体现，宏观产酶动力学的研究表明，产酶速率与细胞比生长速率、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。,与生长相关,与生长部分相关,与生长无关,57,回本节,常用的几种模型,58,小 结,知识点：产酶微生物的种类、要求及应用 酶的生物合成、调节、发酵生产 学习要求：掌握基本概念、了解相关进展 复习题：1. 举例说明常见的产酶微生物的种类 及应用？ 2. 酶生物合成的调节类型、作用机制？ 3. 酶发酵生产的条件及控制的措施？,59,2.4.1 酶生物合成过

25、程 The biosynthesis process of Enzyme,1、中心法则- Central Dogma,2、RNA的生物合成- Transcription,3、蛋白质的生物合成- Translation,Go,Go,Go,60,1、中心法则-Central Dogma,61,2、RNA的生物合成(转录)- Transcription,细胞内RNA的生物功能,(1) 在某些RNA病毒中，其所含的双链RNA作为遗传信息的载体。,(2) 在蛋白质的生物合成过程中，各种RNA起着重要的作用。其中，tRNA作为氨基酸载体，并由其上的反密码子识别mRNA分子上的密码子；mRNA作为蛋白质合成

26、的模板，由其分子上的三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸的排列顺序；rRNA与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成的场所。,(3) 某些RNA具有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，可以催化有关的生化反应。,(4) 各种小分子RNA在分子修饰和代谢调节等方面有重要作用。,62,转录过程的特点,1、转录的不对称性：在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。,反义链 antisense strand（无意义链，负链）：在RNA的转录中，用作模板的DNA链称为反义链。 有义链 coding strand（编码链，正链）：在RNA的转录中，

27、不作为模板的DNA链称为有义链。,2、转录所需酶：依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶，是以DNA为模板的一类RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中，转录酶有所不同。原核生物的转录酶比较简单，由1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3种，分别为RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶，它们都属于寡聚酶，酶的亚基数目为410个，亚基种类有46种。,63,转录过程,起始位点的识别 recognition 转录起始 initiation 链的延伸 elongation 转录终止 termination 转录后加工 modification,64,The E. coli

28、RNA polymerase holoenzyme consists of six subunits: a2bb s.,Possible catalytic subunits,Promoter specificity,Enzyme assembly, promoter recognition, activator binding,Role unknown (not needed in vitro),36.5 kDa,151,155,11 kDa,(32-90 kDa),65,3、蛋白质的合成(翻译)-Translation,翻译: 以RNA中mRNA为模板,按照其 核苷酸顺序所组成的密码指 导

29、蛋白质的合成的过程.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息 各种蛋白质,（核苷酸排列顺序） （氨基酸排列顺序）,66,蛋白质的合成过程,肽链合成的起始 initiation 肽链合成的延伸 elongation 肽链合成的终止与释放 termination and release 合成多肽的输送和加工 transport and modification 蛋白质分子的折叠 folding,67,高效率的蛋白质合成体系,本章 目录,68,酶生物合成的调节类型,转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节和酶降解的调节等,2.4.2 酶生物合成的调节 The biosynthesis regulation of Enzyme,69,A B,E,X,底物水平 的调节,酶水平 的调节,酶活性的调节,酶含量的调节,酶的定位调节,辅助因子调节,生长发育的不同时期 外界环境变化 酶合成与分解速度的变化（基因表达调控）,产物调节,细胞内酶的调控模式,70,酶在细胞内的含量取决于酶的合成速度和分解速度。细胞根据自身活动需要，严格控制细胞内各种酶的合理含量，从而对各种生物化学过程进行调控。 酶浓度调节的化学本质是基因表达的调节。在细胞内，所合成的酶的种类及数量