木霉TP100726菌株固体发酵及所产纤维素酶酶学性质的研究

1、真菌TP100726菌株固态发酵及生产的纤维素酶性质研究。摘要牙齿实验旨在将木糖渣添加到真菌TP100726菌株固体发酵基质中，如果其他条件不变，研究木糖渣替换原配方中的稻草，进一步研究了真菌TP100726菌株生产的纤维素酶的酶学性质和糖化木糖渣的情况。结果表明，木糖渣可替代20%的稻草粉。纤维素酶的最佳温度为50C，最佳pH为5.0C，pH=5.0时比较稳定。木糖渣、柠檬酸缓冲液、原物料1:10，温度50C，pH5.0中糖化木糖渣酶以833 u/ml运行得最多。提供了工业废渣木糖渣用原材料发酵生产发酵糖的基础数据。关键词：固态发酵、纤维素酶、木糖渣、酶特性Abstractthe exper

2、iments is in order to join the xy lose residue in the solid fermentation substrate of Trichoderma TP 100726 strains，And study the xy lose.ts show that xy lose residue can replace 20% of the straw powder . the cellulases optimal temperature is 50c，the optimum ph is 5.0，And it isKey words : solid ferm

3、entation，cellulose enzyme，xy lose slag，properties1引言1.1纤维素酶纤维素是自然界资源最丰富的可再生生物聚合物之一1。如果将天然纤维素分解成可利用的糖类，进一步转化为乙醇、菌体蛋白质、气体燃料(如氢)等物质，对解决当今世界面临的环境污染、粮食不足、饲料资源紧张、能源危机等问题具有重要的现实意义2，纤维素是分解纤维素最有效的生物催化剂31.1.1纤维素酶组成纤维素酶(Cullulase)是一种可以将纤维素分解为多糖或单糖的复合酶系，主要由葡萄糖酶、内皮葡萄糖苷酶、葡萄糖苷酶等组成4。纤维素酶的外体-葡聚糖酶(C1)分解纤维素分子末端的-1，4糖分

4、结合，产生纤维二糖。内体-葡聚糖酶(CX)随机分解纤维素分子内部的肽-1，4糖份结合，产生大量具有不可恢复端的小分子纤维素。钚-葡萄糖酶(CB)分解纤维面团或纤维二糖，形成葡萄糖。1.1.2纤维素酶来源纤维素酶的种类很多，在生物体中广泛存在。植物、动物和微生物都可以产生纤维素酶，其主要来源是微生物。1906年在蜗牛的消化液中首先发现，1945年在微生物中发现，将纤维素酶应用于工业7。目前工业中用于生产纤维素酶的微生物大部分是丝绸真菌，其中80%的工业纤维素酶来自真菌和真菌。木霉属(木霉)、木霉ressiei(木霉ressiei)，本论文采用了属于未知绿色真菌的真菌TP100726菌株。1.2木

5、糖渣木糖渣是玉米棒芯通过酸水解制备木糖后剩下的纤维残留物，主要成分是纤维素、半纤维素和木质素，是化学原料废弃物，价格便宜10。牙齿纤维素资源已通过稀酸水解，结晶度低，被菌体利用，容易被纤维素酶水解，因此也是优质纤维素资源。如果能回收这些纤维的“废物”，将带来巨大的经济和社会效果。1.3纤维素酶酶学性质PH值和温度是影响纤维素酶活力的重要因素，是酶制剂应用的主要参数11。研究纤维素酶的最佳温度及热稳定性、最佳pH及酸碱稳定性有助于提高酶的催化效率，即酶促反应速度。本实验是研究工业菌生产的纤维素酶的最佳温度、最佳pH值、温度稳定性、酸碱稳定性及糖化木糖渣。1.4研究内容和目的本实验固体发酵生产纤维

6、素酶的菌株是真菌TP100726号菌株，本研究建议用木霉菌TP100726号菌株固体发酵基质的稻草替代产业固体废物木糖渣部分。研究固体基质替代后固体发酵生产的纤维素酶的酶学性质及其水解木糖渣的最佳反应条件。具体包括研究固体基质替代后固体发酵生产的纤维素酶的最佳温度、最佳pH值、温度稳定性、酸碱稳定性及糖化糖渣，为合理利用木糖渣将工业废料变成宝藏提供了基本的理论依据。2真菌TP100726菌株固体发酵培养基的最优化2.1测试材料2.1.1测试菌株木霉TP100726菌株，实验室培养。2.1.2发酵原料来源贾伊罗斯渣：由河南杨延矿鹏晶生物产品有限公司提供。半纤维素23.5%，纤维素21.3%，木质

7、素6.70%，其他48.50%1214。麦麸：购买市场，粉碎到40-60颈，备用。秸秆粉：购买市场南阳豆粉：市场购买2.1.3测试试剂和准备(1)考试试剂实验中使用的试剂见表2.1表2.1测试中使用的试剂试剂纯度生产企业磷酸氢二钾A.r .吴江天源化学有限公司氢氧化钠A.r .郑州佩妮化学试剂厂生物传感器标准液B.r .山东科学院生物学研究所3，5-二硝基水杨酸A.r .国药集团化学试剂有限公司酒石酸钾钠A.r .天津金钟仁通化学试剂有限公司无水亚硫酸钠A.r .天津英大化学试剂开发中心酚类物质A.r .天津风能化学试剂技术有限公司。硫酸铵A.r .北京奥博星生命工程学科有限公司(2)准备考试

8、试剂15-18DNS溶液(3，5-2硝基水杨酸):将5g 3，5-2硝基水杨酸放入300毫升水中，逐渐加入NaOH 5g，在45C水槽中混合溶解，然后加入酒石酸钾钠100克，苯酚0.5克，无水亚硫酸氢盐0.05M柠檬酸缓冲液：A液：7.56504g柠檬酸，溶于720ml去离子水。b液：被称为17.646g柠檬酸钠，溶于1200毫升离子水。a液和B液慢慢混合，形成pH=5的缓冲液。CMC试剂的赵霁：据说将1g羧甲基纤维素钠放入100毫升柠檬酸缓冲液中，融化后保存在冰箱里。1 mg/mL葡萄糖标准液：准确地经过80C 100C，以一定重量烘烤的分析顺葡萄糖100 mg放入小烧杯中，溶解少量蒸馏水，

9、然后转移到100 mL容量瓶，用蒸馏水充分混合100 mL后4C；2.1.4测试设备实验使用的设备见表2.2。表2.2测试中使用的设备名字模特生产企业生物传感器分析器SBA-40c山东科学院生物学研究所电热恒温培养箱DH4000 B型天津泰斯特乐器有限公司UV-VIS分光光度计UV - 1700SHIMADZU CORPORATION灭菌锅YXQ-LS-30SII上海博勋产业有限公司电子秤(通用)YP601N上海精密科学仪器有限公司冷藏陈列柜LSC-269CW明星集团有限公司纯系SynergyUV美国Millipore冰箱BCD-207AK合肥美玲有限公司烤箱DV-600YAMATO SCIE

10、NTIFIC CO，ltd .电热恒温水浴锅HSQ-3上海智成分析设备制造有限公司。PH计RHS-3C上海彭顺科学仪器有限公司恒温振荡池晟ZHWY-103D上海智成分析设备制造有限公司。离心机TGL-16B上海安亭科技仪器厂-80C低温冰箱MDF-U4086S日本佐野2.1.5培养基活化培养基：PDA培养基：剥200克皮，将洗净的土豆切成小块，加水煮至1000毫升，过滤至葡萄糖2%，琼脂2%，灭菌20毫升。基础发酵培养基：60%麦麸，稻草粉40%，3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4高液比：13:1.5，充电费：页250ml锥形瓶中加入6.0g固体成分。121蒸压25分钟，初步。2.1.6

11、万亿酶溶液的制备菌株培养一天后，用柠檬酸缓冲液按1336010的高液比3小时左右，然后提取4000r/min离心力10min，清浊是粗酶液。(阿尔伯特爱因斯坦，美国电视电视剧，离心力)2.2测试方法2.2.1木霉TP100726菌株固态发酵2.2.1.1准备徽章远视固体比3360 60%麦麸，40%稻草粉，无机盐溶液： 3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4发酵培养基：固体基质在正交表(表2.3)中组合配制，用6.0g以下的稻草补充。无机离子组成：3%(NH4)2SO4，1%KH2PO4高液比：13:1.5，充电费：页250毫升锥形瓶，添加6.0g固体成分2.2.1.2正交实验(1)正交表设

12、计表2.3正交实验因素和水平因素麦麸木糖渣豆粉11(20%)1(10%)1(0%)22(40%)2(20%)2(1%)33(60%)3(30%)3(2%)(2)在超净工作台上放入培养基，放入紫外线灭菌15min，用无菌操作连接一环孢子，放入28 C恒温培养箱进行培养。(3)在培养过程中，从第5天开始，每24h取一瓶发酵基质病，加入60ml缓冲液(固体充填质量：缓冲液体积=1:10)，提取3-5h(4)提取液在离心管中，4000 r/min离心10 min，上清液为粗酶液。(5) 2.2.4中酶活性测定法测定粗酶液的FPA酶活性和CMC酶活性。2.2.2观察2.2.2.1曲面观测激活用PDA培养

13、基保存的菌株，观察培养过程中真菌TP100726菌株群落形态随时间变化。2.2.2.4真菌形态观察用乳酸石碳酸面兰染色液对真菌TP100726菌株进行染色和观察。首先，在干净的幻灯片上滴入一滴乳酸碳酸棉兰染液，然后用解剖针将真菌菌室边缘有少量孢子的菌丝放入染液中。小心地舀菌丝体，小心地盖上盖子，注意不要起泡。最后用显微镜观察。2.2.3创建葡萄糖标准曲线取5个试管，根据表2.4，加入1000 g/ml标准葡萄糖液和去离子水，获得100 g/mL800 g/ml的标准管。各吸收不同浓度的葡萄糖溶液1 ml、DNS试剂1 ml，均匀混合，在沸水浴中加热7 min，去除，用水冷却，用离子水固定到10

14、 ml，在分光光度计上安装540 nm，测量光密度值，对照空管(0管)。表2.4标准葡萄糖液体比率管道编号1000 g/ml葡萄糖(ml)H2O(ml)葡萄糖浓度C(g/L)001001190.12280.23460.44640.65820.82.2.4酶活性测定方法1921FPA测定：取0.5 ml适当稀释的粗酶液，加入pH 5.0的0.05 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液0.5 ml，搅拌后加入16 cm新华滤纸，在空白对照中加入1ml DNS，加入50 C保温1 h(先加热5 min)。用蒸馏水10毫升，540 nm测定ODM，根据吸光度从葡萄糖标准曲线中找出相应的葡萄糖含量，根据葡萄糖生成量计算酶活动。CMC酶活性测定：取0.5 ml适当稀释的粗酶液，加入pH 5.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制成的1% CMC-缓冲液，空白对照中加入1 ml DNS，50 C保温30 min(预热5 mi