发酵——种子的扩大培养.ppt

1、第四章 种子的扩大培养,种子扩大培养的目的与要求,种子制备实例,种子制备的技术概要,种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,第一节 种子扩大培养的目的与要求,种子扩大培养的概念:,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,第一节 种子制备过程举例,一、谷氨酸生产的种子制备,制备过程,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养

2、,发酵,1、斜面 (AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,2. 一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4 0.1 光

3、密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应,3. 二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,通风量: 50L种子罐1:0.5,搅拌转速340rmin； 250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r min 500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r min,种子的质量要求：,108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2

4、时结束，6.887.0-7.2 活力旺盛 无菌检查,二、青霉素生产的种子制备,制备过程,安培管, 斜面孢子, 大米孢子, 一级种子, 二级种子, 发酵,1、斜面孢子,培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天, 注意湿度50%左右,2、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3、一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27

5、，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4、二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,三、啤酒酵母的扩大培养,三级扩大培养,扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍 第2级到第3级为4-6倍,1，实验室扩大培养,2，车间扩大培养,从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种,接种方式：,从种子罐接种：,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于期,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,第二节 种子制备的技术概要,一、种子制备的过程,实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都

6、在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。,二、实验室阶段,1、培养物选择的原则,目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终的培养物可分为两类：,对于不产孢子和芽胞的微生物 获得一定数量和质量的菌体,对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。,获得一定数量和质量的孢子,菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种子，但操作繁琐。,对于产孢子的微生物,获得一定数量和质量的菌丝体,便于操作，但需要更仔细

7、的控制。,例：放线菌孢子的制备 采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。 培养温度一般为28C。 培养时间为514天。,2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管三角瓶卡式罐种子罐,对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 试管三角瓶摇床种子罐,2、培养基选择的原则,培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基应该是有利于孢子的生长。,在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小，因此为了保证培养基的质量，培

8、养基的原料一般都比较精细。,3、起始接种物的传代问题,细菌,保藏斜面 活化斜面,产孢子,保藏 母斜面 子斜面,目的：使菌种的传代次数尽可能的少。,母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。,子瓶: 大量繁殖，得到大量孢子。 接种：从母斜面上点接种，选取生长好的单菌落 接种时密一点，得到大量的孢子。,孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月,孢子培养,三、生产车间阶段,1、培养物的选择原则,在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。,缩短发酵时间,有利于获得好的发酵结果,菌丝体比孢子要有利：,2、培养基选择的原则,目的：获得一定数量

9、和质量的菌体，因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长，所以营养要比发酵培养基丰富。,在原料方面：不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发酵培养基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化,例：柠檬酸发酵,以蔗糖为原料,成分 斜面 种子罐 发酵 麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5% 20% NH4NO3 0.225% 0.11% K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015% 琼脂 2%,薯干粉,成分 斜面 种子罐 发酵 麦芽汁 麦汁 薯干粉 10% 22-28% (NH4)2SO4 0.5% 琼脂 2%,3、发酵级数的确定,谷氨酸

10、：三级发酵,一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵,青霉素：三级发酵,一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数,发酵级数确定的依据,级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响,级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。,在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面,细菌：二级发酵 茄子瓶种子罐发酵罐 霉菌：如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液一级种子罐（27C,40小时孢子发芽）二级种子罐（ 27C,1024小时）发酵罐 放线菌：四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子,常用微生

11、物发酵级数：,4、接种量的确定,移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积,过大过小都不好，以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。 通常接种量：细菌15%，酵母菌510%， 霉菌715%，有时2025%,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,5、种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,6、种子的质量要求：,量：要求达到一定的浓度,质: 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，产物