基因定位与基因克隆

1、基因定位与基因克隆,中山大学中山医学院 医学遗传教研室 陈争,常用基因定位的方法 体细胞杂交 功能克隆和位置克隆 连锁分析 家系收集 单倍型分析的用途,本节重点,基因定位（gene mapping） 用不同方法，将基因定位于一特定染色体的实际位置，并确定基因在染色体上线性排列的顺序和距离 基因克隆(gene cloning) 用一定的方法把不同位点上的基因分离出来,基因克隆(gene cloning), 功能克隆 位置克隆 候选克隆 功能候选克隆 位置候选克隆,功能克隆(functional cloning)是先研究相关基因的功能，再定位克隆该基因 位置克隆（positional clonin

2、g)是先进行基因定位作图，然后找到来自该定位区的基因并进行克隆,功能,制图,疾病,基因,功能克隆,位置克隆,功能克隆,功能克隆,定位克隆(positional cloning),A T G G T C T C A C T G C A A C C G,A T G G T C T C A C T G T A A C C G,Met,Val,Ser,Leu,Stop,用定位克隆法鉴定的致病基因,用定位克隆法鉴定的致病基因,定位候选克隆,GDB或GenBank,已知的基因或EST,与疾病关系,确定致病基因,候选克隆(candidate cloning),GDB或GenBank,已知基因,已定位的疾病,

3、与该基因关系,确定致病基因,功能候选克隆,候选克隆(candidate cloning),常用基因定位和克隆的方法 染色体多态法 比较制图法 测序法 体细胞杂交法 原位杂交与荧光原位杂交 连锁分析法 染色体畸变法 全基因组外显子测序,体细胞杂交(somatic cell hybridization)又称细胞融合(cell fusion)，是将两个同种和/或不同种的细胞融合成一个新细胞，即杂种细胞(hybrid cell)。, 病毒诱导的细胞融合仙台病毒 化学融合技术聚乙二醇(PEG) 电融合技术电穿孔法,体细胞杂交,体细胞杂交,体细胞杂交,异双核细胞,同双核细胞,合核细胞,杂种细胞,两个同种的

4、动物细胞融合后形成的杂种细胞，细胞核一般保留双核的染色体；不同种动物的细胞融合后，细胞核含有双核的的染色体，但随着增殖传代的过程，会出现保留一方染色体，另一方染色体逐渐丢失的现象。,HAT选择系统,1962, 人类HGPRT - 1964, 小鼠TK -, H：次黄嘌呤(hypoxanthine) T：胸腺嘧啶(Thymidine) A：氨基喋呤(Aminopterin),HPRT,TK,HAT选择系统,异双核细胞,同双核细胞,TK,HPRT,HAT选择系统,体细胞杂交,TK: chromosome 17,原位杂交技术,原位杂交：利用同位素标记的DNA探针，与玻片上的中期染色体进行杂交。是一种

5、直接进行基因定位的方法。,荧光原位杂交(FISH)：用特殊的荧光素标记DNA探针，与玻片上的染色体或细胞组织标本进行杂交。,13号染色体,21号染色体,荧光原位杂交技术,12p部分三体 患者FISH结果,患者母亲FISH结果,连锁分析(linkage analysis)： 利用被定位的基因与在同一染色体上另一遗传座位相连锁的特点，将该基因定位在某一染色体或染色体某一区带上。,连锁,交换与重组 减数分裂时，同源染色体会发生交换和重组,两个基因（标记）之间距离越远，出现交换和重组的机会越多；距离越近，机会越少。,重组值(recombination fraction)：是基因定位时两个基因(遗传标记

6、)间遗传图距的量度，即基因(遗传标记)间的遗传距离。 根据基因的重组值(H) 来计算两位点之间的遗传图距，以厘摩(centimorgan，cM)表示 两个遗传座位间有1%的重组率即为1cM ，1cM约为1000kb,多点连锁定位 (multipoint linkage mapping),利用三点交叉法(three point crosses)，可将某一致病基因定位于遗传标记的框架内，更精确地进行基因定位。 其优点是有助于克服遗传标记的信息有限性，在不同家系，不同的遗传标记提供有用信息。,多点连锁定位,853 5 47 95,非重组体 (A，B) - X - C A X (B，C) B X (A

7、，C),ABC/abc ABc/abc abC/abc aBC/abc Abc/abc AbC/abc aBc/abc,三个基因的排列次序：ACB 遗传距离大约为：A-5.2cM-C-9cM-B,大规模全基因组扫描和 分型的连锁分析,连锁分析与全基因组扫描(genome- wide search) ”策略 有表型(遗传性状或疾病) 就可以肯定在基因组中有它的基因 有基因则在基因组中必有其位置(位点) 该位点与基因组中的另一位点(如多态性的遗传标志) 之间必有某种联系,连锁分析的基本原理： 基因在染色体上呈直线排列，同一染色体上的基因和/或遗传标记形成连锁 位于同一条染色体上的两个位点在减数分裂

8、过程中会发生交换与重组 两个位点之间相距越远,则发 生重组的机率就越高,它们一起 传给后代的机会就越小,遗传图谱上基因或遗传标记位点之间的距离称为图距(map distance), 通常用摩尔(M ) 或厘摩尔(cM ) 表示, 它们之间的关系为1 摩尔等于100厘摩尔。连锁分析是根据家系中亲代与后代不同基因位点间的基因型估计出它们之间的重组率, 然后利用定位函数将重组率转换成以M或cM为单位的图距,DNA 遗传多态性标志 RFLP ：分布不均匀 ，信息量低 VNTR：信息量高，用Southern印迹分析 STR：信息量高，6-10Kb一个，可用多重PCR分析 SNP：信息量低，但分布广，平均

9、1Kb一个，可用自动化分析，现已有1；5；10；50万密度全基因组扫描芯片,当发现家系中疾病位点与某个遗传标志之间毫无连锁(重组率= 50%) 的证据时, 则可将其从该遗传标志附近“排除”; 如果发现它与某个遗传标志之间有一定程度的连锁(0 重组率 50%) , 则知道疾病位点已在该遗传标志附近; 如果它与某个遗传标志之间没有重组(重组率= 0) , 而个体数(即减数分裂事件) 又达到统计学要求, 这时便可知道该遗传标志已经非常靠近疾病位点,一、家系的收集与处理 用于连锁分析的理想家系: 诊断准确, 且为迁移较小、相对封闭的人群 家系的数目及大小需达到一定要求 有明确的遗传相关数据, 如遗传方

10、式、遗传度、外显率等,疾病家系的选择与评估: 疾病家系越大越好。据一般的经验公式,一个有40 多个能提供信息减数分裂事件的三代以上的家系，基本上可得到“肯定连锁”的证据 不管是大家系还是小家系,对每一个体的诊断是至关重要的 注意发病的时间性、治疗效应和发病年龄 、发病史,家系材料的收集与保存： 组织样本：包括血液及血液滤纸片、活检组织及切片、分离的细胞株、毛发、唾液滤纸片等，可在-70或液氮中保存 DNA标本：收集到的血液样本应按严格的方法进行DNA 抽提和纯化，-20 -70中保存 临床资料：临床症状、发病情况、家族史 临床检验结果和家系图,家系分析应注意点： 临床资料完整准确 注意外显不全

11、和迟发显性现象 遗传异质性 基因多效性 非孟德尔遗传现象 X染色体失活现象,STR 的选择与制备 选择STR 一般应达到在染色体上平均覆盖5 10 cM 左右。随后合成扩增这些STR 的PCR引物, 并分别于其中的每一条引物5 端引入几种不同的荧光染料(如6- FAM、HEX、TET )进行标记。目前商品化的ABI PRISM TM Linkage Mapping Set(PE公司出品) 共包含400 个STR , 分辨率 10 cM , 覆盖人类整个基因组，而且杂合度高,PCR 反应 PCR 反应于96 孔板中进行(现多采用在同一反应管中进行多重PCR 反应, 使PCR 扩增过程更加迅速和方

12、便, 而且 PCR 反应液的制备可由与其它设备配套的机器手完成取样和加样等过程),反应终止后的PCR 产物经95 热变性后即可用于电泳检测,电泳检测 PCR 产物的检测过程是在自动激发荧光DNA 测序仪上进行的。当产物在测序胶中进行电泳时, 测序仪上的特殊激光探头可激发荧光, 并扫描每一泳道的PCR产物分子量大小。同时, 与测序仪联接的计算机可直观地将每一产物的产量及分子量大小用曲线峰谱表示出来, 再用相应的软件系统将电泳检测到的数据进行处理,自动基因分型 主要是应用GENSCAN 和Genotyper 软件完成 分型步骤: 准确测量每一泳道内的分子量内标, 然后依靠内标绘出分子量的回归曲线

13、进一步确定每个峰的真实性,对各产物做深入的检测从而根据回归曲线确定每一产物的分子量大小, 并由此转化为片段长度大小 对产物进行孟德尔遗传模式的校对与检查 确定每一产物的基因型并储存起来, 以进行下一步的分析,基因组扫描综合分析 经上述处理后的数据输入相应的软件(如LINKAGE等) 进行Lod 值的计算,并与家系分析得出的数据进行综合处理,从而得出每一个微卫星遗传标志的两点连锁分析Lod 值和多点连锁分析Lod 值,LOD 值(LOD -score) 法 又称优势对数法，最初由Haldane 和Smith (1947) 在分析人类控制色盲和血友病的性连锁基因的重组率时提出。现在广泛应用于遗传标

14、记之间或遗传标记和单基因控制的质量性状之间连锁分析。 LOD 值法实际上是一种最大似然分析方法, 只是在求解重组率的最大似然值时不用常规的数值迭代法, 而是采用一种变形的格点搜索法,对于单基因病，若某一遗传标志的Lod值大于3, 则可认为该遗传标志与致病基因连锁。这样即可将致病基因定位于这一染色体的这一区域内；-2 Lod 3, 不肯定连锁； Lod -2 ，排除连锁。 而对多基因病来说，若某一遗传标志的Lod 值大于1，则认为该遗传标志与致病基因连锁。,精细定位 在该区域内选择覆盖密度更高的位点及扩大家系信息量做进一步的连锁分析,便将这一基因确定于更为狭小的区域,单倍型分析 染色体或染色体区

15、段上的一组等位基因的特殊组合称单倍型,SPG-6基因定位及克隆,SPG-6：D15S128 LOD 值为2.8,SPG-6家系两点连锁分析LOD值结果 LOD SCORE = Marker 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 1. D15S1021 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.74 2. D15S128 2.92 2.87 2.67 2.41 1.83 1.20 0.55 3. D15S646 2.48 2.45 2.32 2.13 1.69 1.19 0.63 4. D15S210 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96

16、1.89 0.74 5. D15S122 4.34 4.32 4.15 3.82 2.97 1.94 0.81 6. D15S986 4.04 3.98 3.71 3.36 2.60 1.75 0.82 7. D15S97 3.42 3.43 3.36 3.18 2.63 1.91 1.02 8. D15S822 -1.02 1.08 1.66 1.74 1.48 1.00 0.45 9. D15S975 -2.59 -0.31 0.29 0.47 0.51 0.40 0.22 10.D15S156 0.04 0.17 0.41 0.52 0.53 0.39 0.19 11.D15S1002

17、-6.72 -2.20 -0.65 -0.05 0.36 0.37 0.22,Marker D15S1021 D15S128 D15S646 D15S210 D15S122 D15S986 D15S97 D15S822 D15S975 D15S156 D15S1002,Band 15q11.2 15q11.2 15q11.2 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12,Start 22566899 22681798 21900044 23299142 23231090 23573159 24382615 24973321 25058809 2

18、5580600 25523217,End 22567048 22682092 21900524 23299555 23231385 23573508 24382758 24973711 25059076 25580939 25523454,Position 4.78 6.11 6.11 6.11 6.11 6.92 9.85 12.30 13.06 14.58 14.58,24,382,758bp,测序研究寻找致病基因： 定位克隆 SPG-6基因定位候选克隆 NIPA1(non-imprinted in PWS/AS 1) CH-5 20484987bp-20485367bp 预测是一种跨膜蛋

19、白，具有受体或转运蛋白功能，在进化过程中高度保守，在神经细胞中高表达,SPG-6家系两点连锁分析LOD值结果（校正） LOD SCORE = Marker 0.0 0.01 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 3. D15S646 2.48 2.45 2.32 2.13 1.69 1.19 0.63 1. D15S1021 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.74 2. D15S128 2.92 2.87 2.67 2.41 1.83 1.20 0.55 5. D15S122 4.34 4.32 4.15 3.82 2.97 1.94 0.81 4. D15S

20、210 4.55 4.51 4.27 3.89 2.96 1.89 0.74 7. D15S97 3.42 3.43 3.36 3.18 2.63 1.91 1.02 6. D15S986 4.04 3.98 3.71 3.36 2.60 1.75 0.82 8. D15S822 -1.02 1.08 1.66 1.74 1.48 1.00 0.45 9. D15S975 -2.59 -0.31 0.29 0.47 0.51 0.40 0.22 11.D15S1002 -6.72 -2.20 -0.65 -0.05 0.36 0.37 0.22 10.D15S156 0.04 0.17 0.4

21、1 0.52 0.53 0.39 0.19,Marker D15S541 D15S646 D15S1021 D15S128 D15S122 D15S210 D15S97 D15S986 D15S822 D15S975 D15S1002 D15S156,Band 15q11.2 15q11.2 15q11.2 15q11.2 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12 15q12,Start 20459309 21900044 22566899 22681798 23231090 23299142 24382615 23573159 24973321 25

22、058809 25523217 25580600,End 20459685 21900524 22567048 22682092 23231385 23299555 24382758 23573508 24973711 25059076 25523454 25580939,Position 6.11 4.78 6.11 6.11 6.11 9.85 6.92 12.30 13.06 14.58 14.58,22,567,048- 20,459,309=2,107,739bp,染色体畸变断裂点精细定位 克隆致病或易感基因 染色体畸变定位和克隆致病基因是应用最早的方法之一，但报道较少。平衡型染色体

23、结构畸变染色体重排断裂点精细定位克隆致病基因的方法再次被重用，得益于人类基因组计划的进行和完成及基因组重叠克隆群的建立 。,利用酵母人工染色体(PAC)或细菌人工染色体BAC重叠克隆作探针，进行染色体原位杂交(ISH)或荧光原位杂交(FISH)- 染色体步移，确定平衡型染色体结构畸变断裂点的具体位置，位置克隆断裂所影响的基因。该方法在单基因多基因病易感基因克隆中应用已呈现出诱人的前景。,利用平衡型染色体异常重排断裂点分子作图方法克隆致病基因是最早应用于致病基因定位和克隆的方法之一，1985年，Ray 等通过对携带X-常染色体易位女性DMD病人的染色体断裂点作图确定了该基因并最终克隆。 该方法的

24、优势是效率高，不需要大样本或大家系，经常通过一例平衡型染色体异常病例的重排断裂点分子作图就能克隆一个候选易感基因。,关键： 选择新发平衡型染色体重排伴特定表型异常病例。 尽可能排除隐藏的亚显微水平异常。 染色体异常断裂点定位要尽量精细、准确。,孤独症伴inv(5) (p13q13)病例 断裂点精细作图,临床表现： 患者女，6岁，39周顺产，出生体重2750g，母亲在孕期和患者出生时的情况正常。14个月学走路，因2岁时不会说话，各方面比同龄儿差就诊。智力低下，IQ=48；现仍不会说话。,对周围事物不感兴趣，眼睛与人没有交流，没有对视现象，胆怯，不愿和其他人玩，独自一人自娱自乐，在不同时期对不同玩

25、具或物品有依恋现象,不能也不愿与人交流。2岁内有过4次癫痫发作史。视觉和听觉正常,头部核磁共振（MRI）未发现异常。家族中没有与神经发育相关的异常病史。,p13.1 q13.3,p13.1, q13.3 q13.3, p13.1,正常5号染色体,Inv(5),A C T G G T C A A T G C A G,T G CA C T G G T C A A A G,A C T G G T C GTCACGT,GACGTAA G T C A A A G,inv(5)(p13q13) BAC克隆FISH-染色体步移结果,5p14.3 RP11-973N21: 19970381-20174363

26、未倒位 5p14.3 RP11-989D21: 21618251-21804568 未倒位 5p14.3 RP11-348C235: 22843498-23005852 半倒位 5p14.3 RP11-280O13: 22883380-23058380 半倒位 5p14.1 RP11-143G19: 25266683-25425310 倒位 5p13.3 RP11-938E3: 29652592-29860143 倒位,5q13.3 RP11-739H23: 74827700-75012774 倒位 5q14.3 RP11-1005F23: 87832522-88019374 倒位 5q14.

27、3 RP11-153K7: 88547863-88682442 半倒位 5q14.3 RP11-276J11: 88605605-88775389 半倒位 5q14.3 RP11-1071C2: 88850996-89058393 未倒位 5q15 RP11-450M18 : 96225280-96427302 未倒位,MR伴t(3;18)(p13;q23)病例 断裂点精细作图,临床表现： 患者7岁，足月剖腹产，出身体重4.1kg,无窒息、核黄胆和高热抽搐史，10个月独坐,1岁会爬，2岁会走。近4岁叫爸爸妈妈，7岁仍不会说连贯性语言，好动，注意力不集中，当时上幼儿园中班，不会写字，耳大。13岁

28、仍只能说简单语言，不能上学，但生活能自理,染色体核型分析： 染色体G显带核型：46,XX,inv(5)(p13q13) 高分辩核型： 46,XX,inv(5)(p13.1q13.3) 双亲核型正常,染色体核型分析： 染色体G显带核型： 46,XY,t(3;18)(p13;q23) 高分辩核型： 46,XY,t(3;18)(p13;q22.3) 双亲核型正常,3,der (3),18,der (18),p13,q22.3,Chr18,3p14.1 RP11-937H3: 67605026- 67816431 3p14.1 RP11-690K16: 69403279-69589135 3p13 R

29、P11-120G9: 70496973-70674836 3p13 RP11-806H15: 70635936-70827471 3p13 RP11-10B21: 70822800-70980695 3p13 RP11-79P21: 70933260-71108032 3p13 RP11-905F6: 71256411-71475547 3p13 RP11-69L8: 71572153- 71733818 3p13 RP11-662O21:71755387- 71920750 3p13 RP11-134C17:72003432- 72173010,18q22.3 RP11-455M13: 71

30、535950- 71751182 18q22.2 RP11-1013D3: 72337190-72516913 18q22.3 RP11-136M16: 72381857-72550618 18q22.3 RP11-460I23: 72397229-72598462 18q22.3 RP11-141I4: 72563794-72713679 18q22.3 RP11-62B21: 72669558-72838472 18q22.3 RP11-695P1: 72829619-73030606 18q23 RP11-1043O21:73348664- 73520584 18q23 RP11-102

31、1L11: 73952626- 74128551,Chr3,易位 易位 易位 跨越断裂点 跨越断裂点 未易位 未易位 未易位 未易位 未易位,未易位 未易位 未易位 跨越断裂点易位 易位 易位 易位 易位,重叠克隆FISH缩小断裂点区域,Maximum range of breakpoint,Potential minimum region of breakpoint,35kb,Maximum range of breakpoint,Potential minimum region of breakpoint,30kb,在此范围内，根据染色体易位后DNA序列发生排列改变的原理，参照两个跨越断裂

32、点片段的序列信息，设计和重新组合引物，进行Long-Range PCR，最终将断裂点精细定位于3号染色体的无基因区域和18号染色体的ZNF407基因的第三内含子内。,long-range PCR引物设计 根据long-range PCR试剂盒特点设计合适扩增长度引物 所有引物都能相互配对，包括复性温度相近，不会形成二聚体,der 3,相互易位,L18q-1F L18q-1R L18q-2F L18q-2R L18q-3F L18q-3R,p13,q22.3,der 18,3,18,L3p-1F L3p-1R L3p-2F L3p-2R L3p-3F L3p-3R,long-range PCR扩

33、增 引物正常配对进行long-range PCR扩增，验证引物设计的效果 根据染色体重排的类型，将不同染色体上的上下游引物配对，反复进行异配long-range PCR扩增及测序,1000bp,750bp,M 1 2 3 4 M,M: DNA size marker; 1. Negative control ; 2.PCR products covering the breakpoint region of derivative chromosome 3; 3: PCR products covering the breakpoint region of derivative chromoso

34、me 18; 4: Negative control.,Chromosome 3 nucleotide position 70789412-70789414,Chromosome 18 nucleotide position 72547016-72547018,der chromosome 3,Chromosome 18 nucleotide position 72547010-72547012,Chromosome 3 nucleotide position 70789408-70789410,der chromosome 18,Chr18(+) TGTTGACCACATCAGCCTCGAAGAGCTTCCCTAGGAAAGCTGT Der18(+) TGTTGACCACATCAGCCT TT