HLA-B27检测.ppt

1、PCR-SSP检测HLA-B27,一、实验目的 掌握HLA基因分型的原理，学习PCR-SSP基因分型方法。 二、实验原理 编码HLA的基因具有高度的多态性，每一个基因座位上有众多的复等位基因，而每一个等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相应的序列特异性引物（ sequence specific primers ，SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，特异性引物仅扩增与其相应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。,实验步骤,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳,抽提DNA,PCR扩增的基本原理,模板DNA的变性（热变性） 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离 模板DNA与引 物的退火(复

2、性)： 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸： DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性-退火-延伸三过程，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR扩增体系,模版DNA 上游引物 下游引物 dNTP（原料） 缓冲体系(各种离子与水) 耐热的DNA聚合酶,Polymorphism in the MHC Variation 1% at a single genetic locus in a

3、 population of individuals Each polymorphic variant is called an allele In the human population, over 1,200 MHC alleles have been identified. MHC genes are the most polymorphic known,Polymorphic residues are located in the antigen-binding groove Variation in amino acid sequences changes the shape of

4、 the groove,Schematic diagram of class I and class II MHC genes, mRNA transcripts, and protein molecules,Every HLA allele has its own unique sequences,Specific sequence primer (SSP) is designed to bind to the allelic sequences complementarily,Sequence specific primer is used to type HLA allele with

5、PCR,Sequence specific primer is used to type HLA allele with PCR,三、实验材料和方法 1、血样：0.2 ml EDTA 抗凝血 2、红细胞裂解液 3、白细胞裂解液 4、PCR 混合液 PCR buffer HLA-B27 SSP Taq dNTP internal positive reference primers,HLA-B27检测操作流程,一、DNA的提取 1、取1ml RBC裂解液入血样管中混匀，裂解RBC; 2、离心4000rpm2min; 3、重复步骤1-2两次，最后用棉签吸干管壁液体； 4、取100ulWBC裂解液入

6、上述WBC管中混匀； 5、将WBC管于60oC水浴消化20min； 6、取出WBC管再于100oC，3-5min，灭活蛋白酶K； 7、离心10000rpm2min。上清即为富含DNA的PCR模板。,二、PCR扩增 1、吸2ul模板DNA入装有PCR混合液的小管中（注意不要加到石蜡油层）； 2、将小管置于PCR仪内进行扩增。（需80min）, 12, 23,预变性： 94 oC 2min 变性：94 oC 12sec 复性：62 1min 延伸：72 30sec 变性：94 oC 12sec 复性：58 oC 50sec 延伸：72 oC 30sec 37 oC 10sec,HLA-B27扩增程序,三、电泳检测 吸PCR产物10ul加到2%琼脂糖凝胶孔内； 将琼脂糖凝胶板置电泳槽内电泳160V20min后取出，观察结果。,四、结果观察,Spe