第一讲-药理实验方法学概述.ppt

1、药理实验方法学,主讲 戴梦红,简介,药理学是一门实验性学科，其理论、学说、设想和结论都取决于实验结果，没有实验数据，就没有药理学的知识和内容； 没有先进的、科学的实验方法，就没有可靠的实验数据，就没有药理学； 药理实验方法是促进药理学迅速发展的前提。,理论教学内容（16学时）,药理实验方法概述 与药理学有关的实验动物的选择和利用 分子生物学方法和体外试验在药理学中的应用 毒理试验方法,实验教学内容（32学时）,量效关系曲线测定（ED50和LD50测定） 动物体内磺胺药浓度测定 药物血浆蛋白结合率测定 大鼠肝S9制备 小鼠骨髓细胞微核试验 小鼠精原细胞染色体畸变分析 大鼠肝微粒体制备及其酶活性测

2、定 小鼠碳廓清试验,第一讲 药理实验方法学概述,一、实验药理学与药理学实验,实验药理学（experimental pharmaco-logy）是药理学的重要组成部分，在药理学的发展过程中占有极为重要的地位。 是以实验研究为目的研究药物作用及其作用机制的学科，是药理学方向的一门应用性专业课。其任务是培养学生掌握和熟悉实验常用仪器的正确使用、实验标本的制备、条件的控制和指标的选择、实验结果的分析、处理等基本技能。,药理学：一门实验科学，其发展和进步都离不开实验获得的结果；而药理学理论的形成也离不开实验的验证。 药理学实验：以实验为基础，按一定的方案，用相关的实验方法或模型试验，得到实验结果，以说明

3、某一药物的作用特点或作用规律。,目的,药理学实验：具体的实践过程，通过药理学实验，实现实验药理学的研究目的，获得药理学的新知识，促进药理学的进步和发展 实验药理学：通过探讨药理学实验的特点和规律，使药理学实验符合科学、规范、准确的要求，有效地解决药理学研究中的实际问题，为药理学研究提供合理方法和技术保障,内容,药理学实验: 解决具体技术问题，是具体的某种实验方法 实验药理学: 研究药理学实验过程中的共性问题，提供药理学实验研究的基本知识,用途 药物（尤其是新药）评价，如作用强度、量-效关系、时-效关系、毒副作用、作用机理等。 包括 主要药效研究和一般药理研究,主要药效研究,原则 用体内、体外两

4、种以上实验方法获得证明，其中一种必须是整体的正常动物或动物病理模型；各项实验均应有空白对照和已知药物对照；实验结果需经统计学处理。 应有两种以上剂量及不同的给药方法，溶于水的药物应做静脉注射。,一般药理研究,应用产生主要药效作用的剂量与给药途 径，对清醒动物或麻醉动物进行一般药理研究 主要研究内容（核心组合实验） 中枢神经系统：观察活动情况和行为变化 心血管系统：心率、心电图、血压 呼吸系统：对呼吸频率和深度的影响,二、药理学实验的常用方法,物理学方法 化学方法 数学方法 实验动物学方法 细胞生物学和分子生物学方法 基础医学和临床医学方法,三、药理实验设计的基本原则,重复（replicaton

5、) 随机（randonmization) 对照（control) 三项统计学原则由实验设计奠基者Fisher提出至今，基本精神未变，但内容有发展,（一）重复,重复是实验设计的首要原则 精确可靠的实验结果应在相同条件下重复出来 能够充分重现的实验，才能称为可靠的实验 要有足够的重复数（实验次数或实验例数），才有可能做出正确的结论。,重复原则的含义,重复稳定性，或称重现性 重复数,减少干扰因素对实验的影响,动物方面 品种、年龄、性别、饲养（条件）等 仪器方面 灵敏度、精确度、操作熟练程度等 药物方面 批次、纯度、剂量、注射速度等 环境方面 温度、湿度、气压等气候因素,重复数与重现性的辩证关系,只有

6、足够的重复数才能取得较高的重现性； 为达到某一重现性，必须有相应的适当的重复数。,重复数的数量与质量的辩证关系,数量是保证重现性的基础 质量是保证实验能够重复的重要条件 应尽量采用精密准确的实验技术，减少实验误差，保证重复实验在相同条件下进行。,相同条件,同时 同地 实验条件 同条件 同种（相同种属品系的动物） 同批（同一厂家生产的同批号样品） 材料条件 同病情（病理模型）,实验条件严密性与代表性的辩证关系,实验条件控制越严密，个体差异越小，越有利于获得准确的结论； 条件控制的过于严密，实验结果的代表性就差，所得结论的适用范围和重现范围会受到限制。 在重复原则中，存在典型性和代表性或普遍性的关

7、系。,（二）随机,实际意义 使每个实验对象在接受处理时，有相等的机会，以减少主观因素的影响，减少或避免偏性误差，不随机即有系统误差，显著性检验就无意义。 随机不是随便 随机必须按随机原则采用随机数字表，以保证实验对象分组的机会相等，随便分组不可能达到每个实验对象机会均等。,绝对随机与均衡随机,绝对随机 又称完全随机，用于例数较多时优越性较大; 均衡随机 先将能控制的主要因素均衡分档，再在每一档中随机取出等量动物分配到各组，使较难控制的因素得到随机安排。,（三）对照,对照是比较的基础，没有对照就没有比较和 鉴别，就谈不上定量研究 自身对照 减少个体差异 组间对照 药理实验中最为常用 其他对照 正

8、常值对照 文献值对照,组间对照,空白对照 不给药，不作任何处理 实验对照 不给药，处理同实验组 阳性对照 给予同类药物或已知标准品 模型对照,阴性对照,不含研究中处理因素的对照组 空白对照 不给任何处理的对照 假处理对照 经同样的麻醉、注射，但不进行关键处理 安慰剂 避免心理状态对药效的影响,阳性对照,药物对照 用已肯定疗效的药物作对照，应为阳性结果 标准品对照 用标准药物或典型药物作为对照，目的是提供对比标准，以评定药物效价 弱阳性对照 用常规疗法或老药、老疗法、老方案对照,四、实验程序,1. 实验动物的选择 种属差异 品系差异 性别差异 2. 给药方法 3. 实验水平（机体水平） 粗分：整

9、体、离体；细分：分子、（亚）细胞、组织、器官、整体动物等。 4. 正常动物和模型动物实验 5. 预防实验和治疗实验 6. 比较试验,五、药效评价标准,1. 药效评价的定量方法 量-效关系分析 为基本分析 量反应的量-效关系 剂量与效应 质反应的量-效关系 剂量与药效反应率 时反应的量-效关系 剂量与潜伏期或持续期 时-效关系分析 药效经时变化的动态规律 构-效关系分析 结构与药效 药-靶关系分析 与酶、受体、蛋白质、载体、膜通道等的关系,2. 药物作用强度与量-效关系 3. 药物作用持续时间与时效关系 药物作用时间包括起效时间和持续时间。 比较药物作用强度 用达到最大作用时的作用强度为指标；

10、比较作用出现时间 用达到最大作用的时间为指标； 比较作用持续时间 用消除速率或实际作用延续时间为指标； 用作用-时间曲线下面积作为综合评价指标，既考虑到作用最大值，又考虑到作用持续时间。,六、实验样本数,影响实验样本数的因素 药物效果：药效强，例数可相应减少 生物差异：个体差异小，标准差小，可少 实验技术：实验手段、仪器和设备严格精密，可少 统计处理：可提高实验效率 两组例数相等时，总例数可适当减少 计量比计数资料实验效率高 同体实验比分组实验实验效率高 特殊的实验设计实验效率高： 拉丁方、正交、交叉等，效率高，信息多，优先采用,药理实验的基本例数 按统计学规定的P0.05及P0.01和药理专

11、业上的实际例数习惯性规定，确定基本例数。 小动物 1030例 （计量10，计数30） 中等动物 820例 大动物 515例,七、实验剂量的确定,安全剂量的探索 由该药与已知药物的效价比值推算 由剂量折算系数法计算,七、实验剂量的确定,剂量递增方案： 应用开始试用量（ds）后，如未出现疗效，也未出现任何不良反应，则按下述方案递增：对于动物实验，按ds、2ds、3.3ds递增，24次可达到预期量，以后均按增长率3033递增。,多剂量实验中剂量间距的确定,整体动物实验 1:3:9 或 1:2:4:8（3或2倍递增），太小，相邻组药效倒置；太大，药效易处于S形曲线平坦处，不利于对比分析 离体器官实验

12、1 : 10:100 :1000（10倍递增） 计算 LD50或ED50的实验 要求0及100之间有36个剂量组，量反应资料取1：0.11：0.5的组间比值，质反应资料取1：0.61：0.85的组间比值,按体表面积计算 A=K(W2/3/10000) A：体表面积（m2） W：体重(g) K：体表面积系数,人与动物及各类动物间药物剂量的换算,如：某药大鼠剂量为250mg/kg，问犬的给药剂量？ （假设一般实验大鼠0.2 kg，实验犬10 kg） 算大鼠体表面积：A=0.031 m2 将mg/kg 剂量换算为mg/ m2剂量： （250mg/kg 0.2 kg）/ 0.031 m2=1608 m

13、g/ m2 算犬体表面积： A=0.5198m2 算犬给药剂量： 1608 mg/ m2 0.5198m2 /10 kg =84 mg/kg,按体型系数换算 dA=dBRA/RB（wA/wB）1/3 dA和dB分别是A、B两种动物的每kg体重剂量（mg/kg) RA和RB分别是A、B两种动物的体型系数 wA和wB分别是A、B两种动物的体重,八、实验的稳定性和灵敏度 及其实验误差的控制,实验的稳定性,影响因素 样本的代表性 如年龄与体重 分组上的差异 体重、年龄、健康状况等不同，分组不均匀，反应性差别明显 实验条件 时间、温度、操作误差等 实验顺序 给药顺序、交叉顺序,表示方法,用变异系数（CV

14、） 或 相对标准差（RSD）表示。 CV越小，实验波动越小，稳定性越好。 CV0.05 稳定性好 CV0.3 波动较大，应改进实验方法或更换测量指标。,提高稳定性的基本原则,从实践和理论上认识受试药物对所用实验动物的生物反应差异性的规律： 实验的专属性 即反应指标在多大程度上体现药物的作用强度 研究剂量-效应关系，应该选择剂量与效应的直线范围宽、剂量增减一定程度后效应增减幅度较明显、相同剂量各次反应之间差异较小的实验方法、模型和指标；,调整样本数 生物差异大的实验，用较多的动物，以提高实验的准确性； 加强实验条件的控制 动物条件：年龄、体重、性别和窝别一致 实验设计方法：合适，以减少实验误差,

15、实验方法的反应类型 量反应或直接测定最小数量，信息量大 质反应 信息量小 统计方法的应用 删除、舍弃由于不正常操作或某些难以预测的因素的影响 重复实验、合并计算等手段提高实验结果的正确性,实验的灵敏性,意义：考察药效方法或模型对药物剂量变化的敏感程度的一项指标。 影响因素： 模型或方法的选择 实验动物 年龄、性别、健康状况 实验设计 量效曲线1684 表示方法：因变系数,因变系数,因变系数即回归系数或回归线斜度,实验误差控制,误差： 指非设计因素带来的使标准差增大的所有差异 认识误差来源从而控制误差,误差来源,1. 抽样误差 存在于任何实验，是实验中的重要误差。 控制方法： 一定数量的样本数

16、重复实验 随机化 使样本具有代表性,2. 非均匀性误差 主要由样本代表性误差所造成，因样本不是来 源于均匀总体，仅在某一范围内抽样。 控制方法：分层随机法分组，既可得到总平均值，又可得到各层平均值。 3. 分配误差 发生在将样本个体分配在一定空间及不同性质的组内。 控制方法：随机化是唯一消除的方法。,4. 条件误差 影响因素：时间、温度、湿度、气压、仪器的稳定性和灵敏度、操作者技术水平和熟练程度、实验动物的状况等。 控制方法：对照、随机 5. 顺序误差 是特殊形式的条件误差，发生在实验进行时。 控制方法：在任何顺序中均应采用随机化，无法随机时，采用对照与实验个体交叉设计。,6. 估计误差 是主

17、观误差，由实验者的主观愿望所造成， 搜集材料、测定数据偏向有利实验结果的方向 控制方法： 实验者必须有实事求是、严谨的工作作风； 尽可能采用现代化、自动化的实验仪器，让仪器作出准确的纪录。,九、实验数据的整理与处理,1. 读 数,数据计算和取值遵循有效数字法则及数字修约规则。,精密度：仪表的最小刻度称为仪器的精密度。读数时，由仪表最小刻度值向下估读一位，数据最末位允许上下一个单位的误差。 存疑数字：指最后一位估读的数字 有效数字：数字中决定数量大小的有意义的数字，即由数字左侧第一个非零数字开始直到最后包括0在内的数字。与仪器的灵敏度有关，反映数据的测量误差,有效数字与仪器精密度,有效数字：仪器

18、最小刻度是准确的，前面的准确数字和末位的存疑数字统称有效数字。 要求： 根据仪器实际具有的精密度正确读数、正确记录实验结果的有效数字，多读和少读均是错误的。 计算过程中允许多保留一位有效数字，但结果必须按规定修约。,例如： 称取小鼠的体重是21.4g，表示体重的真值在21.3521.45g之间，其中，21g是准确的，4 是估计的，3个数字均有意义，因此该数据的有效数字是3位。,2. 有效数字与误差传递,称取 指用分析天平称量，精密度为0.1g 精密称取或准确称取 指用微量天平称取，其精密度为 0.0001g,“0”在数字中的双重性,数据左侧的0起定位作用，仅表示小数点位数，不是有效数字，如0.

19、0214 数据右侧的0，即数字末尾的0是有效数字，不能舍去，如21.40 在仪器中，数字末尾的0表示仪器的精密度，且有1个单位的误差。如0.0618与0.06180，前者为0.000 1，后者为0.000 01。,误差传递规律加减计算,得数的最大绝对误差是各实测值绝对误差之和。 加减得数的小数位数等于或小于实测值中最少的小数位数 如 8.340.03561.1007.2756 最大绝对误差是 0.01+0.0001+0.0010.0111 取舍为 7.2756 7.28,误差传递规律乘除计算,积商的最大相对误差是各实测值相对误差之和。 乘除得数的有效位数等于或小于实测值中最少的有效位数。,如

20、药物 800.0mg , 药液容量50.00mL，动物体重19.5g(0.0195kg)，注射用量0.68mL，则： 用药量为（800.0mg /50.00mL)(0.68mL/0.0195kg)=557.95mg/kg 最大相对误差为0.1/800.0+0.01/50.00+0.01/0.68 +0.0001/0.0195=0.02016=2.016% 最大误差 557.952.01611.25mg/kg 用药剂量应为 0.56g/kg 不能写为560mg/kg，因560有三位有效数字,误差传递规律乘方开方计算,乘方开方计算值的有效位数与原有效位数相同,误差传递规律对数反对数计算,对数反对数计算值的有效位数与实测值相同，但对数的整数部分（首数）不算有效数字，不参与计算 即对数尾数的有效数字与实测值相同。 如：log27.21.43461.435,误差传递规律均数及标准差计算,均数由许多实测值组成，其绝对误差大于各实测值 一般规定均数标准差的有效位数，应根据1/3 标准差的第一位数取舍。