Immunological detection technology.ppt

1、免疫学实验技术，免疫学实验技术，细胞水平检测，分子水平检测，基因水平检测，1。免疫细胞检测，1。免疫细胞的分离和纯化。淋巴细胞及其亚群的检测。免疫细胞功能的测定。检测抗原特异性t细胞，1)分离外周血单核细胞(PBMC)葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心，Percol不连续密度梯度离心，Percol连续密度梯度离心，去除和分离，1)分离和纯化免疫细胞， 多次洗涤除去血小板低渗或0.83%氯化铵溶解红细胞除去单核细胞和粒细胞粘附方法苯丙氨酸甲酯(或L-透明质酸甲酯)法羰基铁粉吞噬法淋巴细胞亚群分离E玫瑰花结分离法尼龙棉柱分离法免疫吸附分离法免疫磁珠法流式细胞术2)淋巴细胞纯化，E玫瑰花结分离法：尼龙棉柱

2、分离法：6mm，T细胞，B精细胞，3)分离B细胞和T细胞， 免疫吸附分离法：羊抗鼠抗体、B、B、免疫磁珠分离法、免疫磁珠分离法细胞表面抗原可与特异性单克隆抗体连接磁珠，在外磁场中，与磁珠连接的细胞被抗体吸附并停留在磁场中，不含此类表面抗原。 免疫磁珠法分为：阳性分离法磁珠结合的细胞为待分离细胞；负分离法不需要磁珠结合的细胞；需要自由单元；一般来说，负分离法的磁珠数量大于正分离法，正分离法运行更多。用磁珠分离细胞的重要指标是：纯度和产量，这取决于与磁珠相连的单克隆抗体的特异性和磁珠的大小(磁性)。然而，过大的磁珠会影响细胞活性。目前，市场上有两种磁性细胞分离系统：*小颗粒(50纳米)Macs *

3、大颗粒(12004500纳米)其他(如Dynal)。小磁珠的优点：用于后续培养的分离，上流式检测。缺点：磁场强、速度慢、产量低、成本高。大磁珠的优点：试管内完整(简单)，容易增减细胞缺点：影响细胞活性不利于培养，纯度低，易堵塞流式细胞仪的喷嘴。优点和缺点：流式细胞术，2。淋巴细胞及其亚群的检测，通过直接免疫荧光、间接免疫荧光、免疫组织化学、葡萄球菌花环法检测CD5分子，微细胞毒性试验，3。免疫细胞功能检测，固有免疫功能，补体，体液中溶菌酶吞噬细胞，大小吞噬细胞(数量和功能)，T细胞功能检测，T细胞增殖试验，T细胞介导的细胞毒性试验，T淋巴细胞增殖试验，1。原理：淋巴细胞，脱氧核糖核酸合成，分化

4、，母细胞，刺激物，细胞。松散的核染色质，2。淋巴细胞转化刺激剂，非特异性刺激剂：异源抗原同源组织抗原，3。检测方法，形态学方法：刺激淋巴细胞(4-6天)母细胞MTT同位素方法：PHA淋巴细胞(54小时)DNA合成期3HTdR混合收集细胞检测射线，优点：灵敏度高，客观性强，重复性好。缺点：需要设备和放射性核素污染。T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞-受各种有丝分裂原或抗原刺激-分泌各种细胞因子-通过免疫学、细胞生物学和分子生物学技术，分别测定细胞因子含量、生物活性或基因表达水平，以反映T细胞的功能。分泌细胞因子功能测定，分泌细胞因子功能测定，分泌细胞因子功能测定，细胞毒性试验，1。原理：靶细胞抗

5、原，T细胞，观察杀伤活性，致敏CTL，靶细胞，2。形态学方法：淋巴细胞肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞同位素方法：肿瘤细胞中含有51Cr的淋巴细胞(CTL)；51Cr释放的测定；3.意义：CTL杀死肿瘤细胞的能力；体内试验；特异性抗原皮肤试验；PHA皮肤试验；接触过敏；b细胞功能测试；B细胞增殖试验；溶血空斑试验；药物对体液免疫和免疫重建的影响B细胞抗体形成功能的体内ELISPOT试验：免疫前后测定相应抗体的滴度，抗IgM/脂多糖/SPA B细胞，经典和被动溶血空斑形成试验，染色计数，离心取上清液测定LDH或AKP，离心取沉淀测定活细胞荧光，测定发光强度，测定CPM值，形态学酶解释，荧光同位素化学发光

6、，自然杀伤细胞活性测定， 靶细胞裂解法，常用的靶细胞： K562细胞系，51Cr放射性核素释放法，吞噬功能检测技术，吞噬活性大致可分为三个阶段：趋化性，吞噬作用和细胞内杀伤作用，在此基础上建立了相应的检测方法。 1.中性粒细胞功能检测技术2。巨噬细胞功能检测技术、中性粒细胞功能检测、细胞趋化功能检测、滤膜渗透法(Boyden chamber法)、琼脂糖平板法、吞噬和杀菌功能检测，1。显微镜检查。细菌溶解法，3。NBT还原试验：酶还原NBT黑颗粒，正常小鼠的库普弗细胞：正常小鼠脾巨噬细胞对90%碳颗粒的吞噬和清除：小鼠对10%碳颗粒的吞噬和清除。每隔一定时间静脉注射一次印度墨水(碳颗粒悬浮液)，

7、取静脉血测量血液碳颗粒的浓度。2。吞噬功能检测，吞噬颗粒：鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等。人巨噬细胞：通过斑蝥应用方法收集的腹膜渗出物，3。巨噬细胞溶酶体酶的测定，酸性磷酸酶的测定，硝酸铅法-磷酸甘油磷酸钠偶氮法-萘酚钠和磷酸非特异性酯酶的测定，萘乙酸法，4。细胞毒性试验，IFN-小鼠巨噬细胞125I-UdR标记肿瘤细胞(DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815)，观察肿瘤杀伤活性、5。巨噬细胞促凝血活性试验，活化的巨噬细胞能与膜结合产生凝血活性因子，并加速正常血浆的凝固；37岁。在正常兔血浆氯化钙混合物单层巨噬细胞管中记录血浆凝固时间。分离和纯化DC，分离DC的原理是基于树突细胞的低密

8、度和半粘附性。具有轻微的暂时性粘附，因此可以与其他非粘附细胞和巨噬细胞分离。小鼠脾DC最早获得于1974年：用DC半贴壁法培养脾内单核细胞3小时后，将非贴壁细胞(淋巴细胞)洗去，纯度约为40%，采用培养板亲和贴壁法可将DC纯度提高80-90%，操作方便，成本低，但提取量少；免疫磁珠分离(CD11c)分离和诱导方法：主要采用直接分离和细胞因子诱导相结合的方法，依次去除红细胞、t、b细胞、粒细胞、单核细胞和巨噬细胞，得到纯化的树突状细胞及其前体，然后在细胞因子的诱导下进行培养；近年来，大量文献报道了细胞因子诱导人CD34细胞分化为树突状细胞。1930年，杜克和华莱士发现，在抗血清和补体的参与下，锥

9、虫可以粘附在人的红细胞膜上，并发现不同的人红细胞对锥虫有不同的粘附能力，因此推测红细胞膜上存在一种与免疫有关的物质。1953年，尼尔森报告说，型肺炎球菌可以被补体调节并结合到人红细胞膜上。这种现象被称为免疫粘附。这种粘附需要激活补体C3，但不需要激活下游补体成分。认为红细胞膜上可能存在免疫粘附受体。直到1963年，西冈证实这种免疫粘附现象是由人红细胞膜的补体C3受体(现在称为CRl或CD35)实现的。1980年，费龙详细研究了CD35的性质，发现85%的CD35存在于红细胞膜上。1981年，西格尔发现红细胞能粘附肿瘤细胞，血清中有许多免疫功能，红细胞膜上的过氧化物酶活性与CD35活性有关，并提

10、出“红细胞免疫系统”的概念。1982年，他进行了红细胞免疫的研究。4。检测抗原特异性T细胞、可溶性MHC/多肽四聚体和二聚体技术，反映机体的免疫功能。肿瘤和免疫缺陷等疾病的诊断和预后监测。监测组织器官移植后受者的细胞免疫功能有利于早期发现排斥反应，以便及时采取有效措施。免疫细胞功能检测的临床应用，1。细胞膜分子：粘附分子、受体、配体、细胞质蛋白和其他细胞成分；免疫标记技术2。可溶性分子：免疫球蛋白、补体、细胞因子、可溶性粘附分子、可溶性受体、细胞分泌的各种分子等。免疫标记技术生物活性测定(白介素-2等)。)分子生物学测定(基因等)。)，第二，免疫分子检测技术，第三，免疫相关基因检测，细胞因子基

11、因组DNA或基因检测北方杂交分析原位杂交聚合酶链反应扩增产物杂交分析BCR和TCR克隆基因重排分析南方印迹杂交聚合酶链反应扩增技术人类白细胞抗原等位基因分型技术序列特异性寡核苷酸探针单链构象多态性，免疫标记技术和标记免疫学创立于20世纪60年代初，并开始以放射免疫分析为代表，许多其他标记免疫分析方法相继问世。免疫放射分析建立于20世纪60年代末，具有良好的灵敏度、特异性和线性范围。酶标免疫测定法建立于20世纪70年代初，价格低廉，检测方便，无放射性污染。在20世纪70年代中期，发光信号通过酶免疫分析建立，具有高灵敏度和快速性。1.标记免疫分析的发展历程。时间分辨荧光免疫分析技术出现于20世纪8

12、0年代初，显示出良好的发展前景。利用时间分辨技术(波长和时间分辨率)测量荧光可以有效消除非特异性荧光，大大提高分析的灵敏度。它具有稳定性好、有效期长、测量速度快、易于自动化等优点，被认为是一种具有良好发展前景的非放射性标记免疫分析方法。20世纪90年代中期，一种全自动化学发光免疫分析仪被开发出来。重点：提高敏感性和特异性的两个主要问题。2.标记免疫分析的分类，根据示踪标记和标记技术分类：放射性元素标记免疫分析酶标记免疫分析荧光标记免疫分析金和银标记免疫分析化学发光免疫分析，根据反应体系的物理状态分类：1。同质标记免疫分析2。异质标记免疫分析放射性核素分析酶标记免疫分析荧光标记免疫分析化学发光免

13、疫分析电化学发光免疫分析根据不同的检测对象分类，免疫组织化学技术，免疫荧光细胞化学技术-普通荧光素，1。常见的异硫氰酸荧光素(FITC):黄绿色四乙基四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC):橙红色荧光，与FITC的黄绿色荧光明显不同，常用于双重标记示踪。藻红蛋白通常用于流式细胞术。7-氨基-4-甲基香豆素(AMC):用于双重标记或多重标记。免疫荧光细胞化学-普通方法1，直接方法：荧光素标记抗体-抗原，普通方法2，细胞抗原，间接方法：抗原已知的未标记抗体-荧光素标记的抗抗体，普通方法3，细胞抗原补体法，直接方法，间接方法，荧光素标记的抗补体抗体在抗原抗体和补体的混合物中，双重免疫荧光染色方法：两种

14、抗原可以在同一标本上定位和定性检测。例如，抗原A的抗体用罗丹明(RB200)标记，其为橙红色，而抗原B的抗体用FITC标记，其为黄绿色。在显微镜下，两种不同的激发光可以检测不同的抗原成分。常用的染色方法有：一步双重染色法：两步双重染色法：1。免疫荧光组织化学技术-通用方法4，1。免疫荧光组织化学技术-通用方法4，2。免疫酶组织化学技术，酶标记法：酶交联并结合在抗体上形成酶标记抗体，未标记抗体技术：酶作为抗原与相应的特异性抗体连接，酶标记法-普通酶，辣根过氧化物酶(HRP):底物为H202，以二氨基联苯胺(DAB)、邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)为供氢体的反应产物可用比色法观察或测定

15、。碱性磷酸酶：底物有对硝基苯磷酸酯、甘油磷酸钠、磷酸萘等。古索氧化酶是一种以葡萄糖为底物的酶，氢供体是硝基蓝四唑鎓(NBT)。酶促反应的最终产物是相对稳定的不溶性蓝色沉淀。酶标抗体免疫组织化学常用方法1、直接法：酶标抗体与组织细胞中相应的抗原反应，酶标抗体免疫组织化学常用方法2、人细胞抗原，底物，间接法：抗原-抗体酶标抗抗体复合物，它是由酶底物发展而来的。3.人细胞银、底物和酶标抗体的三步染色法：由于酶分子的增加，方法的灵敏度提高。未标记抗体-普通酶，过氧化物酶-抗过氧化物酶，PAP (PAP)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)，未标记抗体免疫组织化学方法1，酶桥法：靶抗原特异性抗体(如兔抗人)。人细胞银，底物，未标记抗体免疫组织化学2。巴氏法