1抗原提取.ppt

1、抗原的提取与制备,抗原制备的目的,免疫原：激活T、B细胞 半抗原：检测相应抗体,抗原制备的主要技术途径,天然抗原分离、纯化 完整的细胞(包括细菌抗原等) 细胞内分子 半抗原人工合成、载体联接 农药、兽药 、激素 抗原肽 合成、基因工程制备,完全抗原/免疫原的制备方法,一、颗粒性抗原的制备 细胞性抗原 二、可溶性抗原的制备 细胞内分子,颗粒性抗原的制备,1、采集、分离抗原（制备简便） 新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液稀释。 细菌抗原，新鲜培养物经集菌处理， 2、无害化处理 H抗原因不耐热用0.30.5甲醛处理， O抗原耐热可加热1002h去除H抗原后应用。 H抗原（细菌的鞭毛具有抗原性，称为鞭

2、毛抗原，不同细菌的H抗原具有特异性，常作为血清学鉴定的依据之一。） O抗原(菌体抗原),细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀或层析等方法进一步纯化。 而体液中(如血清等)的可溶性抗原则可直接用生化手段获得所需成分。,可溶性抗原的制备与纯化,1、处理与粉碎 2、蛋白质分离 3、单一组分提取 4、抗原纯度鉴定,处理与粉碎,机械、化学 目的：必须把组织和细胞粉碎，使活性物质释放到溶液内 1、机械 捣碎 、匀浆 、超声波处理 反复冻融法：样品冷却到零下1520度冻固后取出解冻， 如此反复操作。 冷热交替法：把材料投入90度左右水中维持数分钟后取出 投入冰浴内。,高

3、速组织捣碎机,玻璃匀浆器,超声波破碎仪,2、化学 （1）溶菌酶处理法：用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。 如加溶菌酶，37，保温10min ，还有蜗牛酶、纤维素酶 （2）表面活性剂处理：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。,分离方法： 盐析透析 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀 （蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异 而分离的方法 ） 粗提后抗原的浓缩 ： 蒸发法、冷冻法 超滤技术：,蛋白质分离（粗提）,盐析：蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。 *应用最广的是

4、硫酸铵 *分段盐析,真空离心浓缩仪,冻干机,超滤装置,提取,层析技术：凝胶过滤 离子交换 亲和层析 离心技术：差速离心 密度梯度离心 电泳技术： SDS-PAGE,H抗原 O抗原 抗原分离有哪些方法,第三节 半抗原免疫原制备的方法,一、载体的选择 二、半抗原与载体的联接,载体的选择,蛋白质载体：人血清白蛋白（HSA）、 牛血清白蛋白（BSA）、兔血清白蛋白（RSA）、 牛甲状腺球蛋白（TG） 聚合多肽载体：多聚赖氨酸、多聚谷氨酸 高分子聚合物载体：羧甲基纤维素、乳胶和炭末等,半抗原与载体的联接,1、连接方式：物理法（吸附） 化学法 2、化学连接方法： 直接联接法： 间接联接法：,偶联剂的有碳化

5、二亚胺类、戊二醛、氯甲酸异丁酯法、琥珀酸酐法O-（羟甲基）羟胺法、一氯醋酸钠法、重氮化的对氨基苯甲酸法等,半抗原与载体直接联接,碳化二亚胺法 蛋白质-COO + R-N+=CN-R H-N+-R 蛋白质-COO-C-NH-R + 半抗原-NH2 O 蛋白质-C-NH-半抗原 + R-NH-CO-NH R,半抗原与载体直接联接,戊二醛法 蛋白质- NH2 + 半抗原-NH2 + COH-（CH2 ） 3 - COH 蛋白质-N=CH-（CH2 ） 3 CH=N-半抗原,半抗原与载体直接联接,氯甲酸异丁酯法 半抗原-COOH + Cl-COO-CH2 CH（CH3）2 O O 半抗原-C-O-C-

6、O-CH2CH（CH3）2 + 蛋白质- NH2 半抗原-CO- NH -蛋白质 + HO-CH2CH（CH3）2,半抗原与载体间接联接,琥珀酸酐法 O O 半抗原-CH2 OH + C-O-C CH3 CH3 O 半抗原-CH2 O-C-(CH2 ) 2-COOH,半抗原与载体间接联接,O-（羟甲基）羟胺法 半抗原-C=O +H2 N-O- CH2 - COOH 半抗原-C=N-O- CH2 - COOH,半抗原与载体间接联接,一氯醋酸钠法 半抗原- - OH + Cl- CH2 - COONa 半抗原- - CH2 - COOH,半抗原与载体间接联接,重氮化的对氨基苯甲酸法 HOOC- -NH2 + Na