4.免疫酶组织化学技术.ppt

1、免疫酶组织化学技术,第一节 基 本 原 理,抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。,免疫酶组化,免疫学 (抗原抗体反应),酶细胞化学 (底物显色反应),+,特异性 敏感性 定位性 可视性,PAP法,免疫酶组织化学基本组成： 抗原 抗体 放大系统 显色系统,ABC法,免疫酶特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广,一、酶及其特点 酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。,第二节 酶 和 底 物, 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不

2、丧失其活性。 酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。,符合上述条件： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶,（一）辣根过氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内,（二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用,（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱,二、底物及其特点

3、 酶底物酶底物酶产物（显色）,HRP的底物： HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。,HRP显色反应： HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型）,电子供体,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,HRP常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) 黄色,AKP底物： AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色,第三节 酶

4、标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。,一、直接法 原理：HRP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原- 抗体 HRP复合物,直接法,步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。,二、间接法 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物 步骤：二步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种

5、抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。,第四节 酶 抗 酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,一、PAP法 原理：抗原-特异性抗体-第 二抗体（桥抗体）- PAP复合物 步骤：三步法,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,PAP法,HRP,特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物,二、双PAP法： 原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物 抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,双PAP法,H

6、RP,双PAP法,步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重,三、APAAP法 原理：抗原-特异抗体-第二 抗体- APAAP复合物 步骤：三步法,APAAP法,特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂,第五节 卵白素-生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力,一 、ABC法 Avidin Biotin Complex 原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin,酶素化BiotinAvidin - ABC 复合物 抗原-特异抗体- Biotin标记 第二抗

7、- Avidin Biotin HRP,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,卵白素,ABC法,步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广, 某些脏器存在内源性生物素 干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应,SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法,二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： Biotin标记第二抗体,LSAB法, HRP标记Avidin 抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物,步骤：三步

8、法 特点：敏感性高，特异性强， 方法简便,第六节 多聚合物酶法 HRP-多聚合物-抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining,多聚合物酶法,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,EPOS 方法,原理：采用一种具有惰性的多聚 化合物作为骨架，将特异 性抗体和HRP，同时标记 在多聚合物分子上，形成 HRP-多聚合物-特异性 抗体。,步骤：一步法 特点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵,二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP -多聚合物-第二 抗体,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,EnVisionTM方法,特点： 敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。,第七节 基本操作步骤,1. 抗原修复 2.内源性过氧化物抑制 3. 正常血清封闭 4. 第一抗体,5. 第二抗体 6. 酶标记体 7. DAB- H2O2显色,第八节 抗原定位及非特异染色,组织细胞 固定问题 脱蜡不彻底 内源性过