原核表达.ppt

1、生科0801黄开松、克隆基因的表达，目前有5套发育成熟的表达系统1在大肠杆菌中表达2哺乳动物细胞中表达3酿造酵母中表达4枯草芽孢杆菌中表达5培养的昆虫细胞中表达，在大肠杆菌中表达克隆基因的适当启动子和载体系统1的IPTG诱导启动子例如tac trc lac启动子(pUC、pTZ、pSK， pGEM等) 2的T7噬菌体启动子在内选择表达载体(例如pET系载体)的外源基因表达， 由T7噬菌体RNA聚合酶控制的多克隆位点在T7噬菌体RNA聚合酶启动子之后3噬菌体PL带启动子的表达载体(pPLc系列pKC30等)由温度敏感性抑制物质cIts857 低温时可以抑制PL驱动的转录，高温时4用碱性磷酸酶启动

2、子(phoA )和信号pET系统可以多级控制T7RNA聚合酶水平和靶基因的转录，靶蛋白在大肠杆菌中大量表达后，如何有效且简单地达到活性目的蛋白融合蛋白融合两个基因的开放阅读框架将目标蛋白与载体蛋白的氨基或羧基末端连接，构建一般融合载体图解、融合蛋白的载体，并与融合蛋白中的伙伴蛋白(载体蛋白)结合高亲和力， 精制融合蛋白质的蛋白质中含有的组氨酸越多，与Ni2的结合特异性越高，为了将其洗脱需要更高的咪唑浓度。 含有组氨酸标签的目标蛋白质与细胞中的总蛋白质相比，具有更高的Ni2键特异性。 为了得到纯度高的目标蛋白质，需要找到非特异性杂蛋白质从柱中洗脱，与Ni2特异性结合的目标蛋白质不洗脱的适当咪唑浓

3、度的洗脱液(结合缓冲液)。 最后，用咪唑浓度更高的缓冲液(洗脱缓冲液)洗脱目标蛋白质，此时目标蛋白质在咪唑浓度的洗脱液中特异性存在，得到精制的目标蛋白质。 通过切割融合蛋白质得到目标蛋白质，通过化学方法特异性地识别特定的氨基酸残基或氰基溴化物等氨基酸残基，在Met残基之后切割甲酸，通过Asp-Pro后切割酶学方法在目标蛋白质与载体蛋白质的连接区域中分离特异性酶分解部位Xa因子、胰酶， 修订肠激酶、凝血酶、胶原酶、TEV蛋白酶等，在不溶性封入体蛋白破碎(超声波压力冻融溶菌酶)低温下低速离心，溶解含有EDTA、改性剂、DNase的洗涤后的杂蛋白质和核酸，在强脱液剂下体外折叠如果在大肠杆菌中高水平表

4、达蛋白质，则相位差显微镜容易看到的细胞质粒子或包封体是可溶性的蛋白质和膜结合蛋白质容易分离的pET-28a ()表达载体，克隆受体菌是E.coliDH5，表达宿主是E.coli BL21(DE3) 构建重组表达载体1 )载体酶切：限制酶(使用) r基因PCR产物双酶切后回收表达质粒pRSETA，通过T4 DNA连接酶与载体连接。 连接反应体系通过获得含有pRSETA1l R基因片段3l T4 DNA连接酶(5U/l)1l 5buffer2l 3、重组表达质粒的表达菌种(1)，将连接产物转化为大肠杆菌DH5，并基于重组载体的标记(抗kan )进行筛选(2)测序检验目的基因的插入方向及阅读框架均准

5、确，下一步操作前进。 否则，必须筛选更多的克隆，并在不同的酶切点重复子克隆或子克隆。 (3)用该重组质粒DNA转化宿主菌BL21(DE3 )的受体状态细胞，诱导重组蛋白质(1)将重组质粒的单菌落接种LB液体培养基(含100g/m卡那霉素和)，培养37夜。 (2)取1ml培养物一夜，转移到含有100g/ml卡那霉素的100ml液体培养基中，用37从1.52小时培养到对数生长期。 (3)在培养物中添加异丙硫半乳糖苷酶(IPTG )，终浓度为0.2 mM，按照预定的最佳表达条件进行诱导表达。 (4)1200 rpm，离心2分钟，收集菌体。 (5)丢弃上清，向沉淀中加入startingbuffer(2

6、0mm磷酸缓冲液(Na2HPO4和NaH2PO4)、200mM NaCl、10%甘油、ph7.0)500ml，充分悬浮洗涤菌体。 (6)12000 rpm，离心2分钟，收集菌体。 (7)在沉淀中加入15 ml starting buffer，悬浮菌体。 (8)在冰浴条件下，每隔超声波处理3min、处理30sec间隔1min冷却菌液，输出强度56、频率6070、处理时不产生气泡，以热为基准，菌液结束为终止基准。 (9)将9)12000 rpm、4离心20min、上清转移到清灭菌的50ml离心管中。 SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。 目标蛋白在上清中分布后，继续进行下一步纯化操作，制备目标蛋白

7、的体外纯化(1)Ni2nta亲和色谱柱，用去离子水慢慢洗脱，防止气泡导入柱床。 (2)用10倍柱床体积的starting buffer进行预平衡，如上所述将细胞破碎后的上清注入Ni2 -NTA仿射色谱柱中。 (3)用10倍ml的starting buffer漂洗，收集过滤液。 (4)开始使用含有5倍柱床体积的20 mM咪唑的starting buffer进行洗脱，收集洗脱液。 (5)依次用含有5倍柱床体积的40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、200 mM、300 mM和500 mM咪唑的starting buffer洗脱，分别采集洗脱液。 (6)用6)SDSpage检测回收的效果，决