第七章+蛋白质分分离纯化和表征2011.ppt

1、第7章蛋白质的分离、纯化和表征，第7章蛋白质的分离、纯化和表征，1。蛋白质的酸碱性质。蛋白质分子中有许多酸性和碱性解离基团，是具有两性解离性质的化合物。各种离解基团的离解程度与溶液的酸碱度有关。酸碱度越低，碱性解离度越大，蛋白质分子的正电荷越多，负电荷越少。随着酸碱度的增加，解离是相反的。等电点(pI):在特定的酸碱度条件下，蛋白质分子的正电荷和负电荷相等，静电荷为零。这种酸碱度被称为蛋白质的。等电点不是一个恒定值，它会因溶液中盐的种类和离子强度的影响而不同。蛋白质在纯水溶液中的荷电状态完全由氢的离解和结合决定，在这种情况下的等电点称为血浆点。血浆点是蛋白质的特征常数。2.蛋白质分子大小和分子

2、量的测定。蛋白质的分子量范围为61031106 Da。测定蛋白质相对分子量的原理和方法也可以用同样的原理来计算蛋白质的最小分子量。(2)用渗透压法测定相对分子量，以及用渗透压法测定核磁共振法的缺点：无法确定溶液中的蛋白质分子是否均匀。(3)用沉降分析法测定磁流变液。在强离心场中，如果蛋白质溶液的密度高于溶液的密度，溶液中的蛋白质就会沉淀。沉降速率取决于蛋白质的分子量、密度和形状，以及溶剂的密度和粘度。沉降系数(20，w):单位离心场强的沉降速度。定义110-13秒(Svedberg单位)。Mr=RTSD(1V)，沉降速度法，其中：s3360是沉降系数，D3360是扩散系数，3360是溶剂密度，

3、v:是蛋白质的部分微分比容。将纯分析样品置于离心池中，以低速(8000-10000转/分)长时间离心，使蛋白质颗粒沉降形成浓度差，扩散使样品颗粒从高浓度区扩散到低浓度区，最终达到沉降和扩散的平衡状态。Mr=2RTln(C2/C1)2(1v)(x22x12)，沉降平衡法，角速度： V:部分比容：体积密度x1，x2:蛋白质浓度；(4)采用凝胶过滤法测量核磁共振，凝胶过滤(色谱法)可以根据蛋白质的分子量进行分离，同时可以测量蛋白质的分子量。通常，交联葡聚糖(商品名为葡聚糖凝胶)用于测量蛋白质的核磁共振。蛋白质通过凝胶柱的速度，即洗脱体积，与其分子量有关，分子量为33，360。首先，测量几种标准蛋白质

4、的Ve，并相对Ve绘制其分子量对数以获得直线。然后，通过检查标准曲线可以确定待测样品的分子量。(5)磁共振采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定，具有较高的分辨率。它主要是根据各蛋白质组分电泳迁移率的差异来分离和检测蛋白质混合样品。这种差异主要与蛋白质分子的净电荷、分子量和形状有关。当电泳系统含有一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)时，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量，因此蛋白质的分子量可以直接从电泳迁移率计算出来。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-page)，0.51.0，KD 330 220 67 60 36 18.5，KD 94 67 43 30 20.1 14.4，摩尔质量KD 300 200 100 8

5、0 60 50 40 30 20 10，迁移(射频)，Pharmacia :电泳分子标记，1蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质颗粒的大小属于胶体颗粒的范围(1-100纳米)。因为它的分子表面有许多极性基团，所以它是高度亲水的，易溶于水，成为稳定的亲水胶体溶液。蛋白质胶体的稳定性主要取决于两个因素：双电层的水合层、廷德尔效应、布朗运动、半透膜的不渗透性、胶体性质和蛋白质沉淀，蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的和相对的。如果环境条件改变，水合膜和双电层被破坏，蛋白质水胶体将失去其稳定性并絮凝沉淀，这就是所谓的蛋白质沉淀。盐析：中性盐(NH4SO4、NaSO4、氯化钠等)。)蛋白质去除水合层。优点：它不会引起蛋白质变性。盐析：蛋白质在稀盐溶液中溶解度增加的现象。有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂(甲醇、乙醇、丙酮)去除水合层，降低介电常数，增加带电粒子间的相作用。条件：低温操作缩短时间。重金属盐沉淀法