抗体的纯化与制备.ppt

1、抗体的制备与纯化,第一节 常规抗血清的制备方法,一、动物的免疫 二、抗血清的采集,1、免疫动物的选择 2、抗原接种 3、佐剂的应用,动物的免疫,免疫动物的选择,种属与品系 经济性 “R”型与“H”型 经验性适配,抗原接种,剂量： 注射途径： 间隔与免疫时间： 接种次数：,佐剂的概念与种类,概念：与抗原同时或先于抗原进入 机体，以提高抗原的免疫原 性的物质。 种类：非免疫原性物质 免疫原性物质,佐剂的作用机理,延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”,1、采集方法 2、血清的分离与灭活,抗血清的采集,采集方法,一次性采集 多次性

2、采集,抗血清的分离与灭活,血清析出的温度 血清的灭活,第二节 单克隆抗体的制备方法,一、单克隆抗体与杂交瘤技术 二、单克隆抗体的制备过程 三、单克隆抗体的特性,单克隆抗体与杂交瘤技术,1、单克隆抗体 2、杂交瘤技术,表位A,表位B,表位C,抗原,克隆A,克隆B,克隆C,单克隆抗体,由一个识别单一抗原决定簇（表位）的B细胞克隆所产生的同源抗体。,杂交瘤技术,通过融合经免疫的小鼠脾细胞和建系小鼠骨髓瘤细胞，以获得同时具有抗体分泌功能和保持细胞永生性特征的杂交瘤细胞克隆。是获取单克隆抗体的主要技术途径。,单克隆抗体制备过程,1、致敏淋巴细胞的准备 2、骨髓瘤细胞的准备 3、细胞融合 4、选择性培养

3、5、抗体分泌细胞的筛选 6、克隆化过程 7、单克隆抗体的制取,抗原,致敏淋巴细胞,骨髓瘤 细胞,融合,选择性 培养,抗体分泌细胞筛选,克隆化,单抗制取,单抗纯化,单抗鉴定,致敏淋巴细胞的准备,动物选择：品系、年龄、性别、健康状态 抗原接种：方式体内、体外 剂量0.5-100g 次数视抗原而定 间隔视抗原而定 佐剂视抗原而定 收集时间：末次接种后72h,骨髓瘤细胞的准备,细胞株处于良好的生长状态 细胞株保持HGPRT缺陷状态,细胞融合,方式：物理、化学、生物 PEG融合要点：（见图）,致敏淋巴细胞,骨髓瘤细胞,离心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培养液 10ml,离心 100

4、0rpm 7min,37。C摇动、由慢渐快1min、静止1.5min,加入HAT培养液悬浮细胞，置于培养孔内,选择性培养,随机融合后的细胞类型 HAT选择培养原理,随机融合后的细胞类型,细胞组合 HGPRT 生长状态 淋巴细胞 + 骨髓瘤 + 长期生长 淋巴细胞 + 淋巴细胞 + 短期生长 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生长 未融合淋巴细胞 + 短期生长 未融合骨髓瘤 不能生长,HAT选择培养原理,核苷酸从头合成途径（de novo synthesis）,核苷酸补救合成途径（salvage synthesis）,核苷酸,DNA,氨基碟呤（A）,次黄嘌呤（H）,胸腺嘧啶核苷（T）,抗体分泌细胞的筛选,

5、对筛选方法的要求： 多大量样品一次检测 快迅速取得检测结果 准检测结果可靠性高 灵检测方法灵敏度高 常用筛选方法： ELISA、RIA、CDC、IFA等,克隆化过程,概念：建立单一细胞克隆 方法：有限稀释法 克隆建立的标准：连续两次以上100%阳性孔 饲养细胞：同品系小鼠腹腔、胸腺、脾细胞,有限稀释法,计数,103/ml,102/ml,10/ml,0.5-2/孔,单克隆抗体的制取,制取方式： 体外培养罐法 体内腹腔接种 纯化： 盐析、层析、制备型HPLC 鉴定： 特征鉴定Ig类型、亲和力、效价、特异性 决定簇鉴定是否针对同一决定簇,多抗与单抗制剂的比较,多抗 单抗 单抗 （血清） （腹水） （

6、培养上清） 特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1 0.5-5 0.005-0.025 无关Ig含量（mg/ml） 10 0.5-1 其他血清蛋白 大量 极少 均一性 + + 特异性 多决定簇 单决定簇 单决定簇 稳定性 较好 略差 略差 重复性 差 好 好,单克隆抗体的特性,1、理化性状高度均一 2、抗原结合性高度特异 3、生物活性高度单一,第三节 抗体的纯化与鉴定,一、抗体纯化的目的与方法 二、纯化抗体的鉴定与保存,抗体纯化的目的,1、去除杂蛋白 2、去除杂抗体 3、去除非同类抗体,抗体纯化的方法,1、盐析、层析技术 2、抗原吸附,纯化抗体的鉴定,1、多克隆抗体的鉴定 2、单克隆抗体的鉴定,纯化抗体的保存,1、4。C保存 2、 20。C保存 3、冷冻干燥保存,本章小结,1、多克隆抗体的制备 2、杂交瘤技术的原理与应用 3、单克隆抗