《动物细胞制药》课件.ppt

1、第 五 章动物细胞制药,第一节 概 述,细胞学说的建立 组织培养和细胞培养 细胞工程学,第二节动物细胞的形态和生理特点,一、动物细胞的形态 适应功能,形态各异。 离体培养细胞分两类： 贴壁细胞 悬浮细胞,贴壁细胞 生长须有贴附的支持物表面， 自身分泌或培养基中提供的贴 附因子才能在该表面上生长。 两种形态： 成纤维细胞型 上皮细胞型,悬浮细胞 生长不依赖支持物表面，在培养液中呈悬浮状态生长。如淋巴细胞。 兼性贴壁细胞 生长不严格依赖支持物。如中国地鼠卵巢细胞，小鼠L929细胞。,二、动物细胞的生理特点, 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为1248h， 细胞的分裂 周期=间期+分裂期 间期（G1+

2、S+G2） 分裂期（M）,G1期：46h 合成DNA聚合酶 RNA合成 S期：68h DNA合成 G2期：25h DNA量加倍, RNA合成 M期：0.51h 染色体分裂,细胞代数为细胞分裂次数 传代数表示细胞培养分种传代次数 细胞代数=传代数分种数/2 X=(logN-logNo)log2 X 代数 N 培养最终细胞数 No 培养起始细胞数 倍增时间=培养经过时间代数,细胞生长需贴附于基质,并有接 触抑制现象。 正常二倍体细胞的生长寿命是 有限的。 原代培养 有限细胞系 无限细胞系,动物细胞对周围环境十分 敏感; 对理化因素敏感，如： 渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。,动物细胞

3、对培养基要求高 必需氨基酸、维生素、无机盐、 微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。,动物细胞蛋白质的合成途 径和修饰 功能与细菌不同。 动物细胞蛋白质的合成部位： 游离核糖体 粗面内质网的核糖体,游离核糖体合成蛋白质用于 细胞质基质内。 粗面内质网的核糖体合成蛋 白质是分泌的和膜中的整合 蛋白多为糖蛋白。,动物细胞生产药物 缺点:培养条件高、成本贵、产量低。 优点:分泌胞外、纯化方便、翻译 后修饰糖基化，与天然产品一致。,第三节生产用动物细胞的要求和获得,一、生产用动物细胞的要求 原代细胞 二倍体细胞系 转化细胞系,二、生产用动物细胞的获得,原代细胞 是直接取自动物组织器官,经过粉

4、碎消化而获得的细胞悬液（109/g）。 需要大量动物，费钱费劳力。 鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞、 淋巴细胞。,二倍体细胞系 原代细胞经过传代筛选克隆， 从多种细胞成分的组织中，挑 选并纯化出某种具有一定特征 的细胞株。,二倍体细胞有正常细胞的 特点： 染色体组型是2n核型； 贴壁依赖接触抑制； 可传代培养50代； 无致瘤性。,二倍体细胞,转化细胞系 通过某个转化过程形成的，常 由于染色体断裂变成异倍体， 失去正常细胞特点，而获得无 限增殖能力。转化过程可以是 自发的，和人工的，从肿瘤组 织中。,三、常用生产用动物细胞的特性,W1-38：正常胚肺组织人二倍体 细胞系。 核型为2n=46。成

5、纤维细胞， 能产生胶原，培养基用BME （Eagle Basal medium）。,10%小牛血清，pH7.2, 同工酶为G6PD B型。 倍增时间为24h， 有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。,MRC-5：从正常男性肺组织 中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。,有限寿命4246代。增殖 速度较W1-38快，对不良 环境敏感性较W1-38低。 对人的病毒敏感。 用于生产疫苗。,CHO-K1：从中国地鼠卵巢中分 离的上皮样细胞。 核型： 2n=2022。 培养基：DEME培养基 0.1mmol/L次黄嘌呤，0.1mmol/

6、L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。,BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。,用于增殖病毒，包括多瘤病毒、 口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制 作疫苗，现已用于工程细胞构建。,Vero：从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞， 核型2n=60；,培养基为199培养基， 加5%胎牛血清；用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、 狂犬病毒。,Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病 人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.

7、8%的高倍体率，1214条标记染 色体。单条X，无Y。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产 干扰素。,SP2/0-Ag14：通过融合的方法， 从有羊抗红细胞活性的BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，,能耐受8氮鸟嘌呤 20g/ml但 在含HAT 选择培养基中不能存活。 通常用培养基为DMEM，添加10%胎 牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞 和抗体。,Sf-9 1983年从亲代IPLBSF21AE 中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的 蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒 高度敏感。,通常用

8、的培养基为Grace培养基， 添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L 酵母浸液, 10%胎牛血清。用于高 效表达外来蛋白制品。,四、基因工程细胞构建和筛选,在生产中采用更多的更有前景的是 融合细胞及采用基因工程构建的各 种工程细胞。,被用构建工程细胞的动 物细胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalwa、 Vero、 SP2/0、 Sf-9 等细胞。,真核细胞基因表达载体的构建 使用的载体有两类： 病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、 杆状病毒 质粒载体,牛痘病毒： 用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒： 用于基因治疗。 杆状病毒： 用于外源基因表达。,其作为载体的 优点：

9、 双链DNA，易重组 插入78kb DNA不影响正 常病毒粒子的形成。,多角体蛋白和病毒粒子的形 成无直接关系，因此用外源基因 更换多角体蛋白基因，仍能形成 有感染力病毒粒子；,多角体蛋白基因有非常强的 启动子，产生的蛋白质可占全 部蛋白质的20%30%；,用光学显微镜可看到多角体， 可以此作为标记物，选阳性克 隆。 如用家蚕杆状病毒，还可在蚕 体表达外源基因。,质粒载体在细菌和哺乳动物细胞 体内都能扩增。都含有如下基本 成分： 允许载体在细菌体内扩增的质 粒序列。 含有使基因表达的调控元件。,能用以筛选出外源基因已整 合的选择标记。 有时还带有选择性增加拷贝 数的扩增系统。,基因载体的导入和高效表达工程细胞株 的筛选,基因载体导动物细胞 常用方法是： 磷酸钙沉淀法 电穿孔法,磷酸钙沉淀法：溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸钙沉淀， DNA被包在磷酸钙沉淀中， 形成DNA磷酸钙共沉淀物，当 和细胞表面接触时，则通过细胞 吞噬作用而将DNA导入。,电穿孔法： 借助电穿孔仪的高压脉冲电场， 使细胞膜出现瞬时可逆性小孔， 外源DNA沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。,五、细胞库的建立 生产用的工程细胞必须建立两个细胞库： 原始细胞库