免疫电泳技术.ppt

1、免疫电泳技术,四川大学华西医院临床免疫室,武永康,一、免疫电泳技术的发展 二、免疫电泳技术的相关概念 三、介绍几种经典的免疫电泳技术（重点） 四、凝胶免疫电泳技术要点 五、免疫增殖性疾病及免疫检测,本课内容,免疫电泳技术,1953年Grabar和Williams将凝胶扩散置于直流电场中，让电流来加速抗原与抗体的扩散并规定其运动方向，并与免疫沉淀反应相结合，从而加快了沉淀反应的速度，建立了免疫电泳技术，之后又衍生出对流免疫电泳、火箭电泳、及免疫固定电泳等新方法。,一、免疫电泳技术的发展,琼脂电泳与免疫扩散沉淀技术相结合的一门技术。(K) 1电泳优点 （1）将蛋白电泳分开 （2）加快反应速度 2沉

2、淀反应,（一）免疫电泳技术的定义,二、免疫电泳技术的相关概念,免疫电泳,分析,immunoelectrophoresis,蛋白质具有可解离的酸性和碱性基团，在一定PH值条件下，使蛋白质分子带正电荷或负电荷。在电场中，带正电荷的粒子向负极移动，而带负电荷的粒子向正极移动，由于各种蛋白质迁移率不同而分为不同的区带。,（二）电泳的基本原理及其影响因素,I基本原理,电泳（electrophoresis）:带电颗粒在电场中通过液体介质的移动，称为电泳。,1.颗粒（蛋白）本身特性：两性、大小、形状 2.载体性质：最常用的载体是琼脂和琼脂糖凝胶 3.电场强度 4.溶液PH值及离子强度缓冲液的作用 最适电泳缓

3、冲液0.05M，PH8.6 巴比妥缓冲液,II.电泳的影响因素,5.电渗（主要与载体特性有关） 电渗定义 电渗方向与电泳方向的关系 J 电泳迁移率：指在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内移动的距离。 6.电源,定 义：区带电泳 + 免疫双扩散(K) 基本原理：在电场作用下，将标本于琼脂凝胶中进行区带电泳，电泳结束后，于琼脂板旁挖一长形槽，加入相应抗血清，抗体呈直线扩散，电泳分离后的各种抗原呈放射状扩散，反应生成弧状沉淀线。,1.免疫电泳,三、介绍几种经典的免疫电泳技术,将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原彼此分离。,撤去电压，在与电泳方向平行的琼脂打槽并加入相应抗体进行双向免疫

4、分散。,分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成弧形沉淀线。,据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的正常人沉淀线比较， 即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。(K),免疫电泳操作步骤：,结果复杂(经验判断) 可不生成沉淀线（浓度太高或太低），或沉淀线重合,技术评价：,（1）Ig量及单克隆性与沉淀线致密度关系 （2）Ig量与抗体槽距离之间的关系：抗原抗体最适比关系,结查分析（K）,血清蛋白的分析，如多发性骨髓瘤、 r 球蛋白缺乏症,应用：,2. 对流免疫电泳,定义：定向加速度的免疫双扩散技术（K）,对流免疫电泳示意图,在pH8.0的缓冲液中，蛋白质抗原带负电

5、荷向正极泳动；而抗体Ig由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。,电渗：指在电场中液体对于一个固定介质的相对移动。,出现沉淀线洗涤、染色、分析结果,对流免疫电泳操作步骤：,制琼脂板打孔加样电泳,高电渗为特点，但电渗过强会使蛋白质向阴极移动（K） 对流免疫电泳简便、快速、敏感度较高 抗原、抗体比例要求严格 抗原或抗体PI相近或迁移率非常接近，不宜做对流免疫电泳,技术评价：,可用于乙肝病人血清鉴定；甲胎蛋白的测定，但近年多以ELISA替代。,应用：,定义：加速度的单向扩散（J）,3.火箭免疫电泳,火箭免疫电

6、泳示意图,基本原理：琼脂凝胶中的抗体不发生移动(K)，样品孔中的抗原向正极泳动，随抗原含量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰。,制备含抗体的琼脂板(K)打孔加样电泳出现火箭形沉淀线洗涤、染色、分析结果,火箭免疫电泳操作步骤：,“ 峰高浓度标准”曲线：以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量。 唯一的定量方法（K）,火箭免疫电泳的定量测定,l电渗小 2电泳终点时间较难掌握 3开启小电流后再加样，否则形成宽底峰 4IgG电泳应先将其

7、甲酰化，使只带负电荷,火箭电泳操作时应注意以下几点：,PH 8.6时，分析蛋白质抗原带有负电荷 免球测定应先甲酰化，以增加其净负电荷量,技术评价：,大多数蛋白质均可用这一方法进行测定，但目前已被敏感度高，特异性好的ELISA等方法代替。,应用：,基本原理： 将抗血清直接加于电泳后蛋白质区带表面，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合而固定的某种蛋白。,5.免疫固定电泳(K) （immunofixation electrophoresis。IFE）,（IgA 型MM）,海伦娜免疫固定仪,免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定。 鉴定方法：先将患者血清在琼脂上等作区带电

8、泳，之后，加抗血清，依次加抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗K轻链和抗L轻链。必要时还可加抗Fab、抗Fc等特殊抗血清，作用后，洗涤，染色后分析固定的M蛋白成分。 该方法可用于各种蛋白水平的定性检测。,应用：,1电泳载体的选择 与电泳要求的具体条件如摩擦力，电渗、及电泳物质分子量大小等决定。 2凝胶打孔及处理 用打孔器在凝胶板上打孔后，要用琼脂溶液封底，以免样品渗漏。,四、凝胶免疫电泳的技术要点,3加样 加样时琼脂板应先通上微弱电流，以免样品过多自由扩散。 4选择抗原与抗体比例 适当比例抗原抗体反应生成大的免疫复合物，选择抗原和抗体的比例尽量减少前后带现象的发生。,5检测方法 如果沉淀线理想，通

9、过肉眼观察即可定性。 在一些定量测定中，往往辅助以下方法来提高检测的敏感度。 (1)染色 (2)光密度测定法 (3)放射性自显影,6干燥与保存 （1）除盐及游离蛋白质后，干燥 （2）保存 将染色片浸泡在 5l0甘油中30min，保存效果更好。,五、免疫增殖性疾病及免疫检测(重点：临床和检验特点),免疫增殖病淋巴细胞异常增殖,免疫球蛋白异常增生性疾病 （浆细胞异常增殖 ）,良性增殖：常多克隆增殖,恶性增殖：常单克隆增殖,免疫球蛋白恶性增生性疾病的免疫损伤,1.免疫球蛋白合成异常,血液粘稠增加,2.正常体液免疫抑制,3.免疫球蛋白或其片段可以沉积于组织，激活细胞免 疫或补体系统,造成器官损伤,4.

10、浆细胞瘤的浸润性生长,溶骨性病变,多发性骨髓瘤（MM）,特点,I. 介绍几种免疫球蛋白异常增生性疾病,贫血,肾功损害,免疫功能障碍,骨痛,高粘血症,临床特点,检查特点,正常的免疫球蛋白含量明显降低,血M蛋白或尿本周蛋白,骨髓发现大量浆细胞,溶骨性损害,检测方法：火箭和对流用于检测有无抗体，检测MM效果不好（K）,1.血清蛋白电泳M蛋白,2.尿本周氏蛋白检测,3.免疫检测方法,免疫电泳,免疫固定电泳,免疫球蛋白及轻、重链定量,免疫固定电泳,免疫电泳,免疫球蛋白定量,巨球蛋白血症,特点,好发于老年男性,血粘滞过高综合征,临床特点,检查特点,其它免疫球蛋白常在正常范围,血IgM蛋白,淋巴结、肝和脾肿大,重链病：重链的不同可分为型 、型 、型,特点,贫血,细菌感染,淋巴结肿大,临床特点,检查特点,正常的免疫球蛋白含量可降低,重链 ,轻链病：型、型（此型预后差）,特点,发热,肾功能损害,临床特点