第五章 基因工程的操作过程

1、第四章 基因工程的操作过程,一、DNA的体外重组 二、重组DNA导入宿主细胞 三、转化子的筛选,基因工程操作过程,一、 DNA的体外重组（切与接）,1、同种内切酶产生的粘性末端的连接 2、同尾酶产生的粘性末端的连接 3、不同粘性末端的连接 4、不同限制性内切酶的双酶切反应 5、重组率,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,1、同种内切酶生产的粘性末端的连接,极性有两种可能！,2、同尾酶生产的粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,GATCA,T,5,退火,G,CC

2、TAG,GATCC,G,5,GATCA,T,T4-DNA ligase,5,5,Bgl lI,G,CCTAG,GATCC,G,5,GATCA,T,5,5,同尾酶连接后，不能用任何一种酶切，称为焊死！,3、不同粘性末端的连接,BamHI,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,G,ACGTC,3,T4-DNA ligase,5,5,PstI,3,T4-DNA pol,切平,5,5,G,C,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,5,4、粘性末端的更换,BamHI,5,5,T4-DNA ligase,Klenow,补平,GATCC,5,G,5,G,C

3、CTAG,5,5,5,GGATC,CCTAG,5,GATCC,CTAGG,5,5,GGATCGGAATTCCGATCC,CCTAGCCTTAAGGCTAGG,5,5,EcoR I,GGAATTCC,CCTTAAGG,EcoR I linker,5、双酶切反应 1、同步双酶切 能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 没有可以同时适合两种酶的缓冲液，从要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。,6、重组率,1）重组率的定义,重组率 = 含有外源D

4、NA的重组分子数 / 载体分子总数 在常规实验条件下，重组率一般为25 - 75%，它是衡量连接反应效率的重要指标，较高的重组率可以大大简化DNA重组的后续操作。,2）提高重组率的方法,提高外源DNA片段与载体的分子比：3 : 1 - 10 : 1 载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团：,5,5,EcoRI,5,G,CTTAA p,AATTC,G,5 p,5,5,AATTC,G,5 HO,退火,5,G-A-A-T-T-C,C-T-T-A-A G,5,G A-A-T-T-C,C-T-T-A-A-G,OH,HO,OH,HO,碱性磷酸酶,碱性磷酸酶,二 重组DNA分子导入宿主细胞,1、宿主细胞种类

5、原核细胞：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞,2、主要方式转化（transformation）转染（transfection）电穿孔（electroparation）,3、大肠杆菌的转化（transformation） 将重组DNA分子引入感受态细菌（competent cell）,使其在细菌内扩增及表达的过程，1970年建立此技术。 感受态细菌： Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，利于外源DNA吸收，细菌细胞此时的状态叫做感受态 。,CaCl2转化的原理： 当细菌处于0、二价阳离子（如Ca2+、Mg2+

6、等）低渗溶液中时，细菌细胞膨胀成球形，细胞膜通透性增加，处于感受态；此时重组DNA与Ca2+形成羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，重组DNA在42短时间热冲击后进入细胞，在培养基中生长数小时后，球状细胞恢复原状并繁殖，转化效率为105106个细胞/ug。,转化过程：,受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右。,感受态细胞的制备 ( CaCl2 法) 1）将培养液转入离心

7、管中,冰上放置10分钟,然后于4下3000g离心10分钟。2）弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4下3000g离心10分钟。3）弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4）感受态细胞分装成200l的小份,贮存于-70可保存半年。,转化 1）从-70冰箱中取200L感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上。 2）加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10L），轻轻摇匀，冰上放置30min。 3）42水浴中热击 90s ，热击后

8、迅速置于冰上冷却3-5min 4）向管中加入1mL LB液体培养基（不含 Amp），混匀后37振荡培养 1h，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（如Ampr）。,经过转化的感受态细胞在Amp+培养基上长出的单菌落,5）将上述菌液摇匀后取100L涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养 皿，37培养16-24h,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1） 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监

9、测培养液的OD600 来控制。DH5菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5107 个/ml左右比较合适(不同的菌株情况有所不同) 。密度过高或不足均会影响转化效率。,2）质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3）试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(AR，建议买进口试剂),并用超纯水配制，灭菌，最好分装保存于-80度冰箱中。,4） 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管,

10、 tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。,4、真核细胞的转染 转染：将质粒、噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。 磷酸钙共沉淀法、电穿孔法，阳离子脂质体介导转染法。,（1）磷酸钙-DNA共沉淀法： 核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形成出现时，可使DNA黏附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%-5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在

11、细胞中进行稳定表达，用于贴壁细胞转染。,（2）脂质体法（liposomes）： 脂质体（带正电荷，N-1-（2，3-二油酰氧）丙基-N，N，N-三甲铵硫酸二甲酯和二油酰磷脂酰乙胺），与DNA或RNA上带负电的磷酸基团结合，形成由阳离子脂质包裹DNA的颗粒，随后脂质体上剩余的正电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合，通过二者的融合将外源基因导入细胞。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。,瞬时表达和稳定表达,瞬时表达（transient expression）： 导入外源基因后在短

12、时间内基因的表达。因其未整合到染色体上，几天后就消失了。此法常用于基因表达调控研究。 稳定表达（stable expression）： 外源基因整合到了染色体上，可稳定地表达并遗传下去。要获得转基因植物或动物，就必须达到稳定表达。,脂质体介导的哺乳动物细胞转染,实验材料 宿主细胞CHO（贴壁细胞） 脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 6孔细胞培养板 无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 转染级质粒,实验步骤（以6孔板为例） 1）转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（约34105/ml.）转染时，细胞要达到9095%的融合。 2）溶液1：2

13、40ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min） 3）溶液2：无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul） 4）将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。,5）与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 6）将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37，5的CO2中保温56小时。 7）6小时后，更换含有血清的全培养基，在37，5的CO2培养箱中培养4872h检测转染水平。 8）如果做稳定转染，培养24h后，换选择培养基（

14、如含抗生素如G418），同时可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）筛选稳定转染的细胞。,如用于筛选稳定表达的单克隆细胞株，转染24小时后计数，细胞用选择培养基（G418,0.5mg/ml）稀释，以1000个细胞/孔的密度传于96孔板。培养10天左右，有克隆形成，再进行有限稀释法筛选单克隆细胞。,注意事项： 1）细胞的状态，一定要让细胞处于最佳的生长状态再转染，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。 2）无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍。注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液

15、体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分。,3）细胞的汇合度必须要达到90%才能做，细胞太少，容易死亡。 4）加入无血清培养基后56小时更换全培养基。无血清培养基培养时间过长，对细胞是有毒性的！ 5）转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。浓度不要低于0.35ug/ul，太低会导致转染效率降低。 6）48小时mRNA表达最高，72h蛋白表达最高。,5、电穿孔法（electroporation） 在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。此法不需要制备感受态细菌，对哺乳动物细胞、酵母细胞和大肠杆菌等细菌都有效，但转化效率差别很大。总体来说转化效

16、率比较高，可达1091010/ug。,原理利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。,电穿孔转染质粒DNA1) 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前处于对数生长期。2) 胰酶消化收集贴壁细胞，离心收集细胞。用磷酸缓冲液洗细胞两次。 3) 弃上清，用0.5ml电转缓冲液重悬细胞，细胞浓度最好在2106-2107之间。细胞悬液移入0.4cm（细菌用0.2cm的电转杯）电转杯中，加入5-40ug质粒，轻弹混匀。置于冰上10分钟。,4)电击，对大部分哺乳动物细胞，电压为250-40

17、0伏，即625-1000v/cm，电容为960uF。在此条件下，电击时间大约在30-50毫秒。不同的细胞电转的最适条件不同。 5)电击结束后，将细胞置于冰上10分钟。 6)电击后，细胞移入非选择性培养基培养。培养24小时后，计数，稀释15倍以上，用选择培养基培养。2-4天换液，直至抗性克隆形成。也可用于筛选稳定表达的单克隆细胞株，细胞电击24小时后计数，细胞用选择培养基（G418,0.5mg/ml）稀释，以1000个细胞/孔的密度传于96孔板。培养10天左右，有克隆形成。,5、转化率,定义：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数，是衡量转化效率的重要指标。 由于在一般的转化实验中

18、，每个受体细胞最多只能接受一个载体分子，因此转化率也可以定义为每微克载体DNA转化后，形成的受体细胞克隆数。,转化率的影响因素,载体本身的性质：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级。 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低。 受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高,借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。,转化子,重组子,目的重组子,三 转化子的筛选和

19、鉴定,1、抗药性筛选法 原核载体上的抗药基因： 抗氨苄青霉素基因（Ampr ，内酰胺酶) 抗四环素基因(Tetr ，细胞膜修饰蛋白） 抗卡那霉素基因（Kanr，新霉素磷酸转移酶基因） 凡是转入了载体的细胞都获得了这种抗药性，可以在平板上生长菌落。,真核细胞中所用的选择标记： 新霉素磷酸转移酶基因（neo，G418） 潮霉素磷酸转移酶基因（hyg, 潮霉素） shble蛋白（博来霉素，zeocin） 二氢叶酸还原酶基因（dhfr，H,T，MTX）,二氢叶酸还原酶基因,二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase, DHFR）对于真核细胞核苷酸（胸腺嘧啶T、次黄嘌呤H）的合成是必

20、需的。对营养缺陷型dhfr 细胞来说，二氢叶酸还原酶基因可用作选择标记，在缺少胸腺嘧啶和次黄嘌呤的选择培养基中筛选出转化了的细胞。 氨甲喋呤（methotrexate, MTX）是二氢叶酸类似物，是DHFR的竞争性抑制剂，当培养基中含有MTX时，二氢叶酸不能转变成四氢叶酸而生长受到抑制。,新霉素磷酸转移酶基因,新霉素磷酸转移酶基因（neomycin phospho-transferase gene, npt）是一个来源于转座子Tn5编码的分子量为25KD的酶，它催化许多氨基糖苷类抗生素（如新霉素、庆大霉素、卡那霉素、G418）的磷酸化反应，将ATP上的磷酸基团转移到抗生素分子羟基上，阻止了它们与靶位点核糖体的相互作用，从而使这些抗生素失去对细胞的毒性。,Shble蛋白基因,抗生素zeocin，争光霉素或博来霉