植物分子作业.ppt

1、,植物水通道蛋白的生理特性 功能及研究进展,主要内容,1、植物水通道蛋白的发现及命名 2、植物水通道蛋白的结构 3、植物水通道蛋白的类型 4、植物水通道蛋白的生理功能 5、存在问题及展望,一、水通道蛋白的发现及命名：,1988年由Agre等从红细胞膜分离、纯化Rh血型多肽时偶然发现了一种相对分子质量为28 kD的疏水性膜内在蛋白,并根据其分子量命名该蛋白为形成通道的28 kDa膜整合蛋白,简称CHIP28。1991年从红细胞DNA文库中获得CHIP28的cDNA克隆后,推算其氨基酸序列,表明它属于一个功能未知的蛋白。1992年利用爪蟾卵母细胞表达系统结合脂质体重组技术证实了其水通道功能,第一次

2、从分子水平上证实细胞膜上存在水转运通道蛋白。1997年CHIP28蛋白被人类基因组委员会正式命名为aquaporin-1(AQP1)。Agre因此获得了2003年度诺贝尔化学奖。,现在已在细菌、酵母、动物和植物中分离出许多水通道蛋白的同源基因,将其统称为水通道蛋白(AQPs)。Maurel等人于1993年从拟南芥中分离到水通道蛋白Y-TIP,它位于液泡膜上,其cRNA在爪蟾卵母细胞中异源表达时证明其具有水通道蛋白活性。这是植物中首次发现的水通道蛋白。1994年,Kommerloher等用拟南芥根质膜内在总蛋白产生的多克隆抗血清免疫筛选拟南芥cRNA文库得到几个阳性克隆,经鉴定为植物质膜内在蛋白

3、。植物水通道蛋白的发现,使植物生理在观念上得以进步,有力地推动了对植物水分运输与保持的研究。,二、水通道蛋白的结构：,植物水通道蛋白的结构与动物水通道蛋白一样同属于一个古老的跨膜通道蛋白MIP（membrane instrinsic protein）这些膜蛋白的单体分子量在23-30KD之间,由6个跨膜结构域(通过五个环相连)和两端短的NH2、C端组成（图1，图2）。一些氨基酸残基在不同的AQP中很保守。AQP一级结构含6个跨膜区段并由5个环相连，含2个胞内环（B、D）和3个胞外环（A、C、E）其中B环和D环位于膜细胞质一侧，A环、C环和E环位于膜另一侧（图2）。 E环对外界环境非常敏感，可激

4、活AQP功能。,B环和E环疏水性，其余环亲水性。AQP整个分子前后两部分在序列上相似，在膜上呈180度对称镜像结构，接近氨基酸和和羧基端的B环和E环各有由3个氨基酸（天冬酰氨-脯氨酸-丙氨酸）组成的基元，这是该蛋白家族成员共有的高度同源的特征性结构。B环和E环上的189位点和73位点均为汞抑制部位,并位于水通道核心部位即AQP口部附近的可能性大，由此推测AQP的结构呈沙漏模式（图2）。目前已知的植物AQP都是由4个对称排列的圆筒状亚基包绕形成的四聚体,四聚体每个单体都是功能独立的水通道,其中B和E环对水的选择通透性十分重要,其任何变异都会导致水通道活性下降,其中E环的,主要功能是激活AQP。

5、AQP的二级结构由40%螺旋和42%-43%的片层及转角构成：它的三级结构以四聚体形式存在，每一个单体都是独立的功能性水通道，在膜上处于反向相对位置的B环和E环对构成功能性水选择性通透十分重要，E环和B环呈显著疏水，它们的任何变异都会引起水通道活性的下降。,三、植物水孔蛋白的类型:,植物中第1个水孔蛋白Y-TIP是由Maurel等人于1993年从拟南芥中分离出来的。目前,已在拟南芥、烟草、玉米、豌豆、大麦、滨藜、番茄、甜菜、西葫芦及向日葵、甜椒、含羞草等植物中发现了AQP。根据氨基酸序列的同源性,将植物水孔蛋白分为4类:质膜内在蛋白(PIPs),液泡膜内在蛋白(TIPs),根瘤菌共生膜上的内在

6、蛋白NOD26(NLMs)和小分子碱性内在蛋白(SIPs)。,四、植物水通道蛋白的生理功能:,（1）水孔蛋白在跨细胞长途水分运输中的作用。水从植物根到叶的长距离运输有3不同的平行途径：共质体途径（symplastic pathway）、质外体途径(apoplastic pathway）、跨细胞途径(transcellular pathway）.根据组织类型及发育状况的不同，不同的途径对组织整体水透性的贡献不一样。水孔蛋白，尤其是原生质膜上的水孔蛋白，在控制水分的跨膜运输中起着主要作用。根内皮层细胞壁上的凯氏带对水分辐射运输形成障碍。因此根的皮层或内皮层，质外体水分流动必须进入共质体。,在拟南芥

7、中，PIP1水孔蛋白在根内皮层中的表达高于在根皮层中的表达，这与后一种可能性非常符合。木质部薄壁细胞也是水孔蛋白高度表达的地方，在控制水分的渗透和水压运动过程中起着重要的作用。 在研究水孔蛋白在水分长途运输过程中的作用时，人们使用氯化汞来抑制水孔蛋白的活动。氯化汞抑制膜水孔蛋白的机理是氯化汞能与水孔蛋白中的自由硫氢基反应。用0.5mmol/L氯化汞处理离体西红柿根系,水压传导率下降57%,而K+运输则没有任何变化。Carvajal等发现更低浓度的氯化汞(50umol/L)对离体小麦根系的汁液溢泌产生影响.这些结果表明,对汞敏感的水孔蛋白的负调节可以解释在氮或磷缺乏时根中水传导率下降。,Carv

8、ajal等认为,原生质膜的流动性同时下降表明了在调节膜渗透性方面膜脂具有某种辅助作用。 (2)水孔蛋白对细胞的渗透调节作用。水孔蛋白存在于不同类型细胞的液泡膜上，这表明许多植物细胞具有高度的液泡膜水分渗透性。在烟草悬浮培养细胞和洋葱表皮细胞中，液泡膜的渗透性为原生质膜渗透性的100倍，这表明水孔蛋白在液泡膜上水分运输方面具有另外一种作用。液泡膜上无限制的水分运输可以使植物细胞有效地利用巨大的液泡空间来缓冲细胞质内的渗透波动。这样就可以细胞质的坍塌或膨胀，尤其是在细胞间隙的某些变化引起细,胞内渗透发生突然变化的时候，这种作用更为突出。在拟南芥细胞中，质膜体深深地突入到液泡之中，原生质膜水孔蛋白聚

9、集于质膜体上，这可能有利于液泡和质外体之间进行水分交换，而细胞质的渗透波动很小。因此，在植物细胞中水孔蛋白具有很强的渗透调节功能，而这种功能与这些细胞的典型区室化有直接的关系。 （3）促进细胞内外的的跨膜水运输，从而调节细胞外水的平衡，该过程是由质膜AQP来完成。 （4）调节细胞的胀缩。通过存在于液泡膜上的TIP，从而使水快速出入液泡以保证细胞能迅速膨胀和紧缩。,(5) 运输其他小分子物质。AQP对水具有高度选择性，一般不允许其他物质通过。例如拟南芥-TIP已被证明对水高度专一，PIP1a和PIP2b也显示对脲、甘油及离子无通透性。但目前发现少量AQP可同时运输其他小分子物质，例如NOD-26

10、可同时运输离子及甘油。 （6）AQP与叶的生长发育过程有关。Chaumont等发现,ZmTIP1转录活性与叶发育状况有关,表现出快速生长的幼叶大于生长即将结束的叶大于完全停止生长的叶。 （7）AQP与根的水分吸收密切相关。通过HgCl2抑制试验显示,干旱胁迫、正常生长株根系存在大量对HgCl2敏感的水通道蛋白，并且干旱胁迫根系水通道蛋白可能在,数量、活性上发生变化，导致根系径向水分运输阻力增大，使根系在较大的静水压力下，大量的水分通过质外体途径：LP值测定试验表明，干旱胁迫植株根系JV值在0.1-0.3MPa左右有高度的线性关系，并且随着HgCl2浓度增加，LP值逐渐减小并且LP值的下降是由于

11、水通道蛋白引的。Barrowclough等研究了洋葱不同根段水分导度变化的结果表明,仅发育形成内皮层凯氏带的较嫩根端部的LP低，而具有木栓化外皮层的根中部,以及内皮层已木栓化的根基部的LP明显较高.这表明AQP可降低细胞到细胞途径的水分传导阻力.,(8)AQP可能具有缓冲渗透振荡的功能.Krajinski等从与泡囊丛枝真菌共生的苜蓿属(Medicagotruncatula)中克隆到两个AQP的cDNA片段,但Mtaqp1仅在共生菌诱导下表达,从而认为Mtaqp1在共生体中起着缓冲高度区隔化的丛枝中渗透振荡的作用。 （9）AQP可以维持木质部薄壁细胞与蒸腾流间的水势平衡。如果导管蒸腾流水势高于薄

12、壁细胞时，水分就可通过虹吸作用贮存于液泡中，木质部薄壁细胞起贮水库的作用：相反当薄壁细胞水势高时，贮存的水分又可通过虹吸作用释放到导管中。,（10）AQP还参与栓塞的修复。近年来，人们发现根的轴向导水阻力受木质部导管中栓塞的存在与否影响很大，栓塞的形成可显著降低导管导水率，这表明水分张力增大，因而可诱导气孔关闭。 （11）AQP还能防止渗透伤害，Netting认为,质外体水势高时,水分从导管流向叶肉细胞,轻度水分胁迫下,叶肉细胞失水,气孔关闭.若胁迫进一步加重，细胞则处于静息状态。重新供水时，细胞又恢复正常生理状态。AQP参与了所有这些过程。 （12）AQP参与渗透胁迫响应。Suleyman等

13、用0.5%mol/L NaCl处理聚球藻时发现,初期电子传递和氧气释放活性均可逆的快速下降,后期则呈不可逆的缓慢下降。这是由于,盐胁迫导致Na+向胞内流动,而水分则通过AQP流向胞外,因而胞内Na+和K+,可能还有Cl-浓度均升高,以致光系统失活.从细胞水平来说,PIP负责水分的吸收与外排,TIP负责调节膨压,因而细胞结构的完整性得以维持.他们认为,可逆下降由渗透效应引起,而不可逆下降则由离子效应引起,AQP参与这种可逆下降过程。 (13)AQP参与了气孔运动调节.然而至今报道保卫细胞水孔蛋白的文献仍然很少，Ksldenhof将AtPIPIb基因的启动子与汗葡糖昔酸酶(GUS)基因构建成融合基

14、因转化拟南芥,发现AtPIPIb主要存在于分化的细胞及新形成的组织中,且在保卫细胞中也发现了GUS的存在。,Sun等分别利用原位杂交技术证明在蚕豆和向日葵保卫细胞中有类水孔蛋白基因bba解,液泡膜水孔蛋白基因SunTIP7和SunTIP20的mRNA信号.上述研究更进一步确证了保卫细胞中存在水孔蛋白AQP. (14)其他功能.水孔蛋白分布于雄蕊、花药等生殖器官，表明它与生殖有关。拟南介的水孔蛋白表达于根尖的分生区与伸长区，说明它有利于细胞的生长和分化。Ikeda等认为十字花科植物自交不亲和性反应中也有水通道蛋白参与,但对这些蛋白的分子鉴别、特性和功能的研究以及在细胞中的精确定位有待于进一步深入

15、。,五、存在问题及展望：,植物水孔蛋白的发现是植物分子生理学研究的重大进展,水通道蛋白使水代谢的研究跃入了一个全新的阶段，它的发现使我们能够在分子水平研究水的运动。但对于水通道蛋白家族成员的分布、表达、调控机理还需进行深入研究探讨。对于水通道蛋白的“开关”是如何作用的，外界因素影响的机理是什么，水通道蛋白的基因等都知之甚少，有待于进一步的研究。这些都是将来研究的主要方向。迄今,AQP的研究已取得了很大的进展。 今后这一领域的研究可从以下几方面进一步深入: (1)水分在细胞内除了极少量用作光合作用底物外,主要起维持各种生理生化过程所需的液相环境的作用,AQP正是通过空间转移(亚细胞、细胞、组织水平)水分而影响这些过程。因此应将AQP与其它生理生化过程结合起来研究,从抗旱分子生物学角度着手,搞清干旱信号产生、AQP活性调节的信号转