毒物分析-第五章.ppt

1、第五章 毒物分析常用方法-免疫分析,放射免疫分析(Radio Immunoassay,RIA):是一种将同位素放射测量与免疫原理相结合的分析方法。 用于微量分析，定量测定受检标本中的抗原,检测限达到pg级(110-12g)。 酶标免疫分析(Enzyme -Labled Immunoassay,EIA)。 用酶标代替放射性同位素标记。无放射危害，操作方便、安全。,（一）、基本原理,放射性核素标记的抗原(radionuclide labeled antigen)和非标记抗原(unlabeled antigen)（标准抗原或被测抗原）同时与限量的特异性抗体(specific antibody)进行竞

2、争性免疫结合反应(competitive immune binding reaction)，其竞争关系可用下式表示：,一、放射免疫分析,假设受检标本中不含抗原时的反应条件为： 4（Ag*）2（Ab）2（Ag*Ab）2（Ag*）（2）,根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应结果。,在标本中存在抗原时，举例如下： 4（Ag*）4（Ag）（2Ab） 1（Ag*Ab）3（Ag*）1（AgAb）3（Ag）（3）,2*Ag + 2Ag+ 2Ab *Ag + Ag + *AgAb +AgAb,*Ag与Ag的免疫活性完全相同，对Ab具有同样的亲和力，当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统

3、时,两者相互竞争结合特异性抗体。,当*Ag和Ab为恒定量，Ag和*Ag的总量大于Ab上的有效结合点时，*Ag-Ab的形成是随着Ag量的增加而减少，剩下来的未结合或游离的*Ag则随着Ag量的增加而增加，称为竞争结合反应(competitive binding reaction) 抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比因此测定*Ag-Ab或*Ag的放射强度即可推出被测的Ag量。,若将抗原抗体复合物与游离标记抗原分开，分别测定其放射性强度，就可计算结合态的标记抗原（B）与游离态的标记抗原（F）的比值（B/F），结合率B/(BF)，这与标本中的抗原量呈函数关系。 用一系列不同剂量的标

4、准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。,RIA标准曲线,标记用的核素有放射射线和射线两大类。 射线主要为131I、125I、57Cr和60Co 射线有14C、3H和32P 放射性核素的选择首先考虑比活性。 例如125I比活性的理论值是64.38104GBq/g,有较长半衰期的14C最大比活性是166.5GBq/g，1mol125I或14C结合到抗原上，125I的敏感度约比14C大3900倍。125I有合适的半衰期，低能量的射线易于标记，常用的RIA标记物。,1、标记物,2、标记方法 标

5、记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。,直接标记法:将125I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上。 优点： 操作简便，为125I和蛋白质的单一步骤的结合反应，它能使较多的125I结合在蛋白质上，故标记物具有高度放射性。 只能用于标记含酪氨酸的化合物。 含酪氨酸的残基如具有蛋白质的特异性和生物活性，则该活性易因标记而受损伤。,间接标记法（又称连接法）是以125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。 特点： 操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。 但此法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质。如直接法标记引起蛋白质酪氨酸结构改变而损伤其免疫及生物活性时，也可采用间接法。 它的

6、标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入125I液引起的生物活性的丧失。,例 氯胺T直接标记法。 氯胺T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物的钠盐，在水溶液中逐渐分解形成次氯酸，是一种氧化剂。在偏碱溶液中（pH7.5），氯胺T将125I的I氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。反应式：,含有特异性抗体的抗血清是放射免疫分析的主要试剂，常以抗原免疫小动物诱发产生多克隆抗体而得。 抗血清的质量直接影响分析的灵敏度和特异性。 抗血清质量的指标主要有亲和常数、交叉反应率和滴度。,3、抗血清的检定,（1）亲和常数 亲和常数（affinityconstant）常用K值表示。它反映抗体与相应

7、抗原的结合能力。 抗血清K值越大，放射免疫分析的灵敏度、精密和准确度越佳。,（2）交叉反应率 放射免疫分析测定的物质有些具有极为类似的结构，针对一种抗原的抗血清往往对于其类似物会发生交叉反应。 例如甲状腺素的T3、T4，雌激素中的雌二醇、雌三醇等。 因此交叉反应率反映抗血清的特异性，交叉反应率过大将影响分析方法的准确性。,（3）滴度 滴度系指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度。 反映抗血清中有效抗体的浓度。 在放射免疫分析中滴度为在无受检抗原存在时，结合50标记抗原时抗血清的稀释度。,（二）、测定方法,放射免疫分析三个步骤： 抗原抗体的竞争抑制反应 B和F的分离 放射性的测量。,1、抗原

8、抗体反应 将抗原（标准品和受检标本）、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。 不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。,受检标本抗原含量高，抗血清的亲和常数较大:可选择较高的温度（1537）,短时间的温育 抗原抗体复合物较为牢固。,2、B、F分离技术 在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，需加入合适的沉淀剂或吸附剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（F）的分离。,（1）聚乙二醇（PEG）沉淀法 PEG沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合率比用

9、第二抗体为高，且温度高于30时沉淀物容易复溶。,（2）活性炭吸附法 小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子复合物留在溶液中。 例：在活性炭表面涂上一层葡聚糖，使它表面具有一定孔径的网眼，在抗原与特异性抗体反应后，加入葡聚糖活性炭。放置510min，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。,3、放射性强度的测定 B、F分离后，即可进行放射性强度测定。,测量仪器 液体闪烁计数仪 晶体闪烁计数仪,每次测定均需作标准曲线图 以标准抗原的不同浓度为横坐标，以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图，放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/(BF)、B/F和B/B0。

10、 标本应作双份测定，取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。,系列试管中加入规定量*Ag、Ab 再依次加入已知不等量Ag 培育后分离Agf 与AgAb 测定放射活性 以B/F或F/B作纵座标，对Agt作图 样品同法操作，据此可测定未知Ag浓度,总结：免疫法测定步骤,二、酶联免疫法（ ELISA ） (enzyme linked immunosorbant assay),（一）、基本原理,酶联免疫吸附试验是一种固相免疫测定技术，其先将抗体或抗原包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应，后加入酶标抗

11、体与免疫复合物结合，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离的未结合成分，最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其吸光度(A)值的大小进行定性或定量分析的方法。,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。 测定方法中3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物。,根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。,双抗体夹心法 间接法测抗体 竞争法,（二）、酶联免疫法的类型,1、双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 将已知抗体吸附于固相载体, 加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。,操

12、作步骤： 用已知特异性抗体包被固相载体 加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体 加底物显色，终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。,2、间接法 此法是测定抗体最常用的方法 将已知抗原吸附于固相载体，加人待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加人酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。,操作步骤： 包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体 加待检标本: 经过温育(372h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质； 加酶标抗抗体: 再次温育(372h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体 加底物显色: 终止反应后，目测定性或用酶标仪测光密度值定量测定。,3、竟争法 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例, 将特异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,操作步骤： 用已知特异性抗体包被固相载体； 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一