深部真菌感染检验技术的研究进展.ppt

1、深部真菌感染检验技术的研究进展,李若瑜 北京大学第一医院皮肤科 北京大学真菌和真菌病研究中心,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,条件致病真菌感染危险因素,国外： 血液系统肿瘤病人 粒细胞减少、 _骨髓移植 器官移植 ICU HIV感染,国内： 广谱抗生素应用 ICU 皮质激素 糖尿病 静脉插管,美国院内血源性感染最常见的病原体 (Dian Microbiol Infect Dis,1998;30:121-129);,Coagulase(-) staphylococci,S.aureus,Enterococcus spp.,Candida spp.,Esche

2、richial coli,Klebsiella spp.,Pseudomonas spp.,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,真菌感染流行趋势,探讨危险因素，了解病原菌类别 病原菌种类：白念珠菌占首位、其次为热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌。非白念珠菌的比例有所上升； 曲霉感染在血液系统肿瘤患者中十分突出； 其它少见菌深部感染引人注目。,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,临床真菌学面临挑战,免疫功能受损患者的增加 真菌感染日益严峻的问题 病原菌种类不断变化，新出现的致病菌 临床真菌工作者面临机遇和挑战,研究生物学特性，

3、准确鉴定病原菌 探索诊断新方法，快速诊断真菌病 药物体外疗效监测，提高治疗水平,临床真菌学的任务,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,系统性真菌感染的致病菌,条件致病菌 致病性双相真菌 念珠菌 组织胞浆菌 曲霉 球孢子菌 隐球菌 芽生菌 接合菌 马内青霉 镰刀菌 孢子丝菌 暗色真菌 酵母菌 毛孢子菌 枝顶孢霉,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,了解特殊病原真菌生物学特性,形态学 温度试验 营养需求 血清学特性 分子生物学特性 药敏特性,毛孢子菌 枝顶孢霉 镰刀菌 孢子丝菌 马内菲青霉 外瓶霉,2004年检验年会大会发言 20

4、04年6月8-11日 江苏省连云港市,完成全基因序列测定的病原真菌,白念珠菌 新生隐球菌 粗球孢子菌 烟曲霉、构巢曲霉 组织胞浆菌 卡氏肺孢子虫,真菌感染诊断新方法的应用,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,真菌病诊断非培养方法,乳胶凝集试验检测新生隐球菌抗原 ELISA法检测念珠菌和曲霉抗原 免疫组化、原位杂交技术用于深部真菌病诊断 种特异性引物并应用于菌种鉴定 曲霉、外瓶霉、镰刀菌、孢子丝菌,抗真菌药物体外药敏试验,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,抗真菌药物的体外药敏试验,意义 确定药物抗菌谱 检测菌株敏感性 监测临床

5、耐药菌株 方法: 测定最低抑菌浓度或杀菌浓度 液基法:NCCLS 固基法: E-test,ATB-Fungus,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,体外抑菌试验结果的影响因素,温度和孵育时间,接种菌量,培养基,折点判定,建立高重复性的的试验方法非常必要!,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,NCCLS抗真菌药敏试验方案,1982年NCCLS开始组织专家进行研讨 1992年：NCCLSM27-P,酵母菌液基稀释法药敏测试标准化方法提案 1995年：NCCLSM27-T，属试验性质 1997年：NCCLSM27-A，属确认性质 1

6、998年：NCCLSM38-P，丝状真菌微量液基稀释法提案 2003年：新版M38-A，产孢丝状真菌抗真菌药敏试验方案,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,NCCLS M27-A方案,酵母菌的液基稀释法抗真菌药敏试验参考方案 （Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts） 已批准的标准方法，包括微量稀释法（microdilution) 主要适用于：念珠菌和新生隐球菌,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,NCCLS

7、 M38-A方案,产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药敏试验方案（Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidia-Forming Filamentous Fungi） 提出的标准方法，微量稀释法(microdilution) 主要适用于：曲霉、镰刀菌、米根霉、波氏假阿利什霉、申克氏孢子丝菌（菌丝相）等。,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,M38-A 方案菌悬液制备,PDA ， 35 纯化并活化： -曲霉、波氏霉、米根霉和申克孢子丝菌：7 天 -镰刀菌

8、： 35 48-72h后转至 25-28 至 7天 在分光光度计530nm波长通过,相当于McFarland 0.5浊度, 终浓度: 0.4x104 _ 5x104 cells/ml,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,分光光度计调整菌悬液浓度,曲霉、申克氏孢子丝菌OD值调整至0.09-0.11（80-82%透光率）； 镰刀菌、波氏假阿利氏霉以及根霉OD值调整至0.15-0.17（68-70%透光率）； 然后以RPMI-1640液体培基稀释50倍；波氏假阿利氏霉接种悬液应以较低的（50%）稀释倍数接种； 1：50稀释后得到2倍终浓度的接种悬液，其浓度为0.4-

9、5104CFU/ml；,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,M38-A 方案孵育条件,根霉：21-26 hrs 大多数菌种：46 - 50 hrs 波氏霉：70-74 hrs,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,M38-A 方案结果判定,必须与生长对照比较 按以下五级标准判断: 4-生长无减少 3-生长轻微减少, 相当于对照的75% 2-生长有明显的下降，相当于对照的 50% 1-仅有少量生长, 相当于对照的25% 0-无生长,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,常用药物MIC值判定,二性霉素

10、B：MIC值判定为没有可见生长时的最低药物浓度；若出现拖尾，临床上可能表现为耐药。 氟康唑、酮康唑或氟胞嘧啶：MIC值判定为相对于生长对照有50%或更多的生长减少时的最低药物浓度。 伊曲康唑及新三唑类：MIC值判定为100%抑制生长，时的最低药物浓度；对于曲霉属以及其它条件致病性丝状真菌出现拖尾时，可能反映临床上耐药。,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,M38-A方案调整的几方面,受试药物中增加了新型三唑类药物Posaconazole，Ravuconazole，Voriconazole； 终点判读时将伊曲康唑的MIC值定义为100%生长受抑，其原因是伊曲康唑和其它新型三唑类药物，判读终点时不存在拖尾； 质控菌株在原有近平滑念珠菌ATCC22019和克柔念珠菌ATCC6258的基础上，增加了参考菌株黄曲霉ATCC204304和烟曲霉ATCC204305；质控药物也有相应的增加。,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,M-38-A质控株、参考株及其MIC值范围,2004年检验年会大会发言 2004年6月8-11日 江苏省连云港市,MIC检测中存在的问题.,如何与临床疗效相结合？ -联合用药和耐药菌株问题 如何简化方法并提高重复性？ 对不产孢真菌如何建立标准化