水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应开题报告

1、湖州师范学院毕业设计（论文）开题报告学 生 姓 名高霞婷班级060922学号06092204专 业生物技术指 导 教 师采克俊刘 莉开题时间2009.6.28设计（论文）题目水泡性口炎病毒在草鱼肾细胞中的复制和病变效应选题意义研究现状及存在问题选题意义：水泡性口炎病毒（VSV病毒）为弹状病毒科（Rhabdoviridae）,水泡病毒属（vesiculovirus）,其代表种是水泡性口炎病毒印第安纳（VSV Indiana）株和新泽西（VSV-New Jersey）株。VSV病毒引起的水泡性口炎（Vesicular stomatitis, VS）是一种急性高度接触性传染疾病，以马、牛、猪等动物较

2、易感染，绵羊和山羊也可感染。临床上以舌、唇、口腔黏膜、乳头和蹄冠等处上皮发生水疱为主要特征，还有糜烂及溃疡，其症状与口蹄疫(FMD)、猪水疱病(SVD)相似。人也有感染VS，引起流感样症状。本病被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病。在我国VS为外来动物病，国家进出境动物检疫对象中将VS列为二类疫病。随着经济发展的国际化，动物及动物产品的国际贸易量逐渐增加，外来动物病传入我国的风险日益加大。为防止国外动物疫病入境，保护我国畜牧业及水产业的健康发展，对该病进行充分的了解和研究具有特别重要的意义，尤其是对病原VSV病毒的研究。研究现状：VSV病毒的诊断方法较多，包括病毒的分离培养、电镜观察、琼脂免疫扩

3、散、免疫电泳、酶联免疫吸附试验（ELISA）、补体结合(CF)试验、中和试验（VN）、聚合酶链式反应（PCR）等。OIE推荐夹心ELISA (IS-ELISA)、CF用于鉴定病毒抗原，液相阻断ELISA (LP-ELISA)、VN、CF则用于血清学试验。而PCR法则是近年来发展起来是一种快速、高敏感、准确的诊断技术。该法全部试验可在1d内完成，能够达到快速诊断的目的，并且具有很好的特异性与重复性，国内外都有相关的研究报道。目前，国内外有关关鱼类病毒的研究包括鲑草梅病毒(TSD)、淋巴囊肿病毒(LCDV)、系统性虹彩病毒(SU)、斑点叉匙回病毒病(CCDV)、银大麻哈鱼疙疹病毒(SaHV-2)、

4、传染性胰坏死病毒病(IPNV)、鰤鱼腹水病(YAV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、春季鲤病毒(SVCV)、白斑狗鱼幼鱼弹状病毒(PFRV)、草鱼出血病病毒(GCHV)等。但是关于VSV病毒对鱼类影响方面的报道并不多，因此研究该病毒对鱼类的影响成为了一个迫不及待的课题。存在问题：1.VSV病毒对细胞又何影响？2.VSV病毒能否在CIK细胞中复制？3.VSV能否引起CIK细胞单层产生空斑？研究目标和内容目标：本实验用VSV病毒感染草鱼肾细胞（CIK细胞），分别于攻毒后12 h、24 h、36 h后观察其细胞病变效应，同时利用RT-PCR方法检测其在CIK细胞中的复制。观察细胞病变效应发现，

5、病毒感染后的细胞圆缩、聚集、脱落、并有空泡形成。随着时间的延长，病变效应加剧，并逐渐凋亡。RT-PCR结果证实了VSV病毒可在CIK 细胞中复制。在空斑实验中，证实了VSV病毒不能使CIK细胞单层产生蚀斑。内容：1.翻译一篇与实验研究相关的英文文献；2.综述VSV病毒的研究概况；3.CIK细胞培养；4.用VSV病毒感染CIK细胞；5.病毒RNA制备及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制；6.实验数据整理及结果分析。研究方法步骤和措施1. CIK细胞培养 用高糖DMEM培养基培养CIK细胞，置27恒温箱中培养。每天观察，及时更换培养液。2. 用VSV病毒感染CIK细胞 在培养瓶中进行细胞

6、铺板，当细胞生长至70%80%时，弃去原培养液，加入980l高糖DMEM培养液（不含双抗、不含胎牛血清）及20 l 1000 g/mL的VSV病毒，体积比为1/50，置27 恒温箱中培养。分别在12 h、24 h、36 h后，显微镜拍照记录细胞病变。3. 总RNA制备及RT-PCR测定CIK细胞中VSV病毒的复制 (1) 病毒RNA的提取 (2) cDNA合成 (3) PCR扩增 (4)电泳鉴定4. VSV病毒对CIK细胞单层的空斑实验在24孔板中进行细胞铺板，当细胞生长至70%80%时，弃去原培养液，加入梯度稀释后的病毒液，孵育1.5 h后弃去病毒液，加入含1.5%小牛血清的甲基纤维素覆盖，

7、置于27恒温箱中培养，3 d后弃去甲基纤维素，用0.1%的结晶紫染色1min，漂洗，风干，观察空斑和计数。研究的总体安排与进 度第一阶段 确定研究课题并制定研究计划 2009年6月8日-2009年6月30日第二阶段 收集资料和研究参考文献 2009年7月1日-2009年7月15日第三阶段 进行预试验 2009年7月16日-2009年8月1日第四阶段 进行整体试验 2009年8月2日-2009年10月31日第五阶段 撰写论文 2009年11月1日-2009年11月30日第六阶段 论文修改 2009年12月1日-2009年12月14日第七阶段 论文审核 2009年12月15日-2009年12月26

8、日第八阶段 准备论文答辩 2009年12月27日-2010年1月3日主要参考文 献1 温志远.水疱性口炎病毒印第安纳株反向遗传操作系统的建立及重组病毒的构建D.内蒙古:内蒙古农业大学,20062 Mead DG, Ramberg FB, Besselsen DG, et al. Transmission of vesicular stomatitis virus from infected to noninfected black flies co-feeding on nonviremic deer mice J. Science,2000,287: 485-4873 杨桂梅,徐自忠,高洪.

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