转录组测序技术原理及应用.ppt

1、RNA测序技术原理及应用,遗传的中心法则,基因组转录组表观遗传组蛋白组层次,什么是转录组？,RNA是解读基因组的关键,RNA,Protein,Phenotype,Genotype,DNA,RNA 测序技术,Workflow of RNA-Seq,样品检测 文库制备 Cluster Station Illumina Sequencing 生物信息分析,Total RNA样品检测,Agilent 2200 检测 OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0; RIN7,新型安捷伦2200 TapeStation系统是新一代测序（NGS）、生物微阵列芯片分析和qPCR工作流程以及

2、蛋白质纯化和抗体生产过程中对生物样品进行质量控制（QC）的理想解决方案。 可扩展的通量16联或96孔微量滴定板 快速得到结果平均每个样品只需一分钟便可获得结果 使用简单可直接使用的ScreenTape预制胶条简化了工作流程 样品用量少每次运行仅需要不到2ul样品,检测报告-合格样品,棉铃虫/果蝇,检测报告-不合格样品,Workflow of RNA-Seq,样品检测 文库制备 Cluster Station Illumina Sequencing 生物信息分析,真核mRNA的纯化,mRNA的纯化主要通过的磁珠与生物素吸附原理从而分离纯化 Oligo（dT）25磁珠纯化原理主要是mRNA的3的p

3、oly A与磁珠在bindingbuffer的作用下相结合。磁珠通过MPC（磁分离器）从溶液中分离出来。 mRNA与磁珠结合后，再用Tris-HCL在加热条件下解离洗脱到溶液中。,链霉亲合素包被磁珠+生物素标记Oligo（dT）25+poly（A）,原核mRNA的纯化,Ambion MICROExpress Kit,LNA扣锁型探针,mRNA反转录-fragment+RT,纯化过的mRNA样品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。 加入1l的stop buffer终止反应。 加入沉淀剂（NaAc 糖原 无水乙醇）沉淀产物。 RT ds cDNA,末端修复(防止自连）

4、 cDNA 3末端加A Adapter连接,第一天,消化DNA,mRNA的分离,mRNA的打断,cDNA的合成,第二天,末端修复,加接头,胶回收,3端加A,第三天,PCR,PCR胶回收,文库制备,文库质量检测： Aligent 2100：片段大小、纯度、浓度 qPCR：片段大小、浓度 手工检测：跑胶验证。,Workflow of RNA-Seq,样品检测 文库制备 Cluster Station Illumina Sequencing 生物信息分析,HiSeq 2500,Applications of RNA-Seq,17,RNA-Seq (Transcriptome),Workflow of

5、 RNA-Seq(Transcriptome),生物信息学分析,RNA-Seq (Transcriptome),Characterize the transcriptome in unparalleled detail,Technique 2,20,RNA-Seq (De novo transcriptome assembly),RNA-Seq (Transcriptome resequencing),RNA-Seq (De novo transcriptome assembly),文库构建,测序,组装,De novo assemble a transcriptome组装流程,数据产出统计及测

6、序数据的成分和质量评估 组装结果分析（Contig 长度分布、Scaffold 长度分布、Unigene 长度分布） Unigene （transcript）功能注释 Unigene 的GO 分类 Unigene 代谢通路分析 预测编码蛋白框（CDS） Unigene 表达差异分析（两个或两个以上样品） Unigene 在样品间的差异GO 分类（需两个或两个以上样品）和Pathway 富集性分析,De novo assembly transcriptome 信息分析主要内容：,De novo assembly transcriptome信息分析流程,Unigenes的GO 注释,Pathway

7、 分析,RNA-Seq (Transcriptome resequencing),cDNA文库构建,测序,比对到参考序列,Transcriptome resequencing比对流程,比对统计 基因表达注释 基因差异表达分析 基因结构优化 可变剪接分析 预测新转录本 cSNP分析,Transcriptome resequencing信息分析主要内容,Transcriptome resequencing信息分析流程,应用-优化转录组注释信息,基因结构优化 可变剪接鉴定 基因融合鉴定 RNA水平SNP分析,Genomic intergenic region,Reads cluster,Paired

8、 Reads distribution,优化基因结构鉴定新的转录本,Paired-End (PE) Reads,Reads 比对到参考序列基因间区域,鉴定可变剪接（ Alternative Splicing ）,exon1,exon2,exon3,exon1,exon2,exon3,exon1,exon3,common reads,junction reads,mRNA,鉴定基因融合,分析RNA水平SNP,转录组重测序比对软件：SOAP De novo 转录组测序: 组装软件：SoapDenovo 比对软件： SoapSNP,36,转录组研究技术横向比较,转录组测序的优势,RNA测序与芯片检测

9、基因数比较,RNA测序与芯片 检测基因的表达量分布,Genome Res 2010,Case,实验材料收集： 叶片，花序, 果实, 根 时间点：0 , 4, 8, 12, 16, 20和 24 h 将每个时间点采集的样品均匀混合 测序策略： Illumina 测序，1G data,1. High light 2.Heat 3. Cold 4. Salt 5.Drought,抗逆相关可变剪接,外包膜蛋白16 (AT2G28900),Intron-retention,Control,Low Temperature Resistance,低温胁迫相关的AS,低温胁迫下这个内含子和对照相比被保留了下来

10、，揭示了可变剪接有重要功能。,AS调节机制,CCA1,生物钟相关基因，例如调节气孔的开关等,RNA-Seq单端测序 （Quantification） 等同于数字表达谱(DGE),Workflow of RNA-Seq单端测序（Quantification）,生物信息学分析,RNA-Seq单端测序（Quantification） 生物信息分析内容,测序数据评估 筛选差异表达基因 表达模式聚类分析 GO 功能富集分析 Pathway 富集分析 蛋白互作网络分析,RNA-Seq单端测序（Quantification）信息分析流程,RNA-Seq与基因芯片优缺点比较,case,Plant Physiology 2010,取样： 选取在成熟季节开花后 5, 10, 和15个星期葡萄分别代表葡萄果实成熟中的三个时期（post setting, veraison和ripening） 数据量： 超过59M reads数据， 长度在36-44bp之间,运用RNA-Seq技术对葡萄果实发育过程中复杂转录特征的研究。,表二 reads在基因组上的分布情况,表一 测序数据,葡萄RNA-Seq单端测序,浆果发育三个阶段共有、特有基因表达分布图,基因表达量分布,表达簇的分类分布情况,差异表达的基因GO功能注释-分成了19个功能类群-按照基因在三个不同时期的表达趋势进行分类，分成8个c