第十二章植物组织培养室的构建及培养基、植物材料消毒液.ppt

1、第二章 植物组织培养实验室的构建 及植物组织培养基,植物组织培养实验室的构建,主要内容： 一、植物组织培养实验室设计 二、仪器和设备 三、玻璃器皿和用具 四、培养条件,一、实验室设计 标准组织培养室包括 洗涤室（区） 制备室（区） 灭菌室（区） 储放室（区） 操作室（区） 培养室（区） 观察室（区） 药品室（区）,、洗涤室（区） 玻璃器皿和塑料器皿 、洗 包括用自来水、洗液、洗涤剂 清洗 、干 包括自然晾干和烘箱干燥,2、药品室 存放常用的化学试剂 无机盐类、有机物、生长调节剂等,3、制备室 完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装等。 主要设备： 药品柜、防尘橱（放置培养容器

2、）、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培养基配制用玻璃仪器. 培养基的配制 生理生化测定,4、储存室（区） 存放配制后的培养基 或未用完的培养基,5、灭菌室 即消毒室，是培养基、玻璃器皿、塑料 器皿和其他物品消毒灭菌的地方,6、操作室 也称接种室，是开展组织培养研究包括接种、继代、细胞融合等的场所。主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。 接种室宜小不宜大，一般78平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。,7、培养室 培养室：培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培

3、养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。,培养室：,植物组织培养材料移到田间前， 先移到驯化室进行炼苗，带生根成活后， 再移到田间苗圃。,二、仪器和设备 1、烘箱 陈列于洗涤室 作用：干燥洗后的器皿 高温干热灭菌 测定培养物的干重 气浴,2、冰箱 陈列于制备室中 作用：低温保存材料，存放药品、培养基母液 激素、酶制剂。,3、灭菌锅 陈列于灭菌室中 类型：普通医用消毒锅 大的高压灭菌锅 作用：培养基、水和各种器皿的消毒,4、超净工作台 陈列于操作室（接种室）中 类型：垂直式和水平式 作用

4、：无菌操作,5、pH计 陈列于制备室中 作用：测定培养基及酶液的pH值,6、显微镜 陈列于观察室中 类型： 倒置显微镜 原生质体观察 普通显微镜 染色体和叶片气孔观察 荧光显微镜 细胞活力观察 解剖显微镜 立体观察,7、天平 陈列于制备室中 作用：称取大量元素、微量元素、酶制剂,三、玻璃器皿及用具 1、玻璃器皿 培养用的：试管、三角瓶、培养皿等 显微镜下观察用的：细胞微室、载玻片、培养皿等。,2、微孔过滤器（细胞过滤器） 灭菌用：如激素 一般用石棉滤膜,3、细胞计数器 统计培养细胞的用具 4、接种用具 如镊子、剪刀、解剖刀、接种针等,思考题 1、一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间？ 2、组

5、织培养常用的设备有哪些？各有何用途？ 3、组织培养的环境条件有哪些？,培养基的成分 培养基的制备 培养基的选择,培养基的制备是组培的核心工作，外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化、成苗都取决于选用不同成分的培养基来调节控制的。,培养基的成分,无机营养成分+有机营养成分=基本培养基,1.无机营养成分：,1)大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。 （C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca） 氮：由硝酸盐和铵盐提供 铵盐过高会引发玻璃化苗,2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。（Fe，Cu， Zn，B， Mo， Mn等） 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。

6、 Fe由螯合物的形式提供:Na2.EDTA 无机盐供应不足时，植物会出现缺素症状。,1、无机营养成分,当某些营养元素的供应不足时，愈伤组织所表现出来的症状如下：,氮：某些组织表现出一种花色素苷的颜色；不能形成导管；,氮，钾或磷：细胞过度生长，形成层组织减退；,硫：非常明显的褪绿；,铁：细胞分裂停止；,硼：细胞分裂停滞，细胞伸长；,锰或钼：影响细胞伸长。,不同营养条件对植物组织培养的影响-MS Salts,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,The explant is completely covered with

7、green shoots, and roots are developing on the lower surface,No MS salts No sign of regeneration from explant at all.,MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots （1/10）MS,MS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or

8、 callus. (2MS),碳源：最常用的是蔗糖，提供碳源；维持培养基渗透压。 葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。 麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。 蔗糖使用浓度在2%3%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培养时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。,2、有机营养成分,维生素：维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。 虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上，还明显不足，通常需加入一至数种维生素，以便

9、获得最良好的生长。,主要有VBl (盐酸硫胺素)、VB6 (盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、有时还使用VH(生物素)、 VB11(叶酸)、VB12（钴胺素)等。 一般用量为0.11.0mgL。有时用量较高。VB1 对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6 能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。,氨基酸(AA)：是很好的有机氮源，可直接被细胞 吸收利用。最常用的是甘氨酸，其 他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、 天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 有时应用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-000mg/L之间。由于

10、它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。,天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。, 1)椰乳 是椰子的液体胚乳。 2)香蕉 主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。, 3)马铃薯(potato) 去 4)水解酪蛋白 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%),肌醇 (myoinosltol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子

11、磷酸残基相结合形成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸 可进一步形成磷脂，参与细胞膜的构建。 使用浓度一般为100 mg/L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,No sucrose (0%),Sucrose reduced to 1%,Sucrose increased to 5%,The explant is completely covered with green shoots, a

12、nd roots are developing on the lower surface,Very few shoots have developed on the explant. No roots and no callus.,Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occured,Shoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The re

13、sult is comparable with the control medium,不同营养条件对植物组织培养的影响-sucrose,在培养基的各成分中，植物激素是植物培养基的关键物质，它以很微小的量影响着再生植株的形态建成。 基本培养基 保证培养物的生存和最 低的生理活性 植物激素 定向的诱导外植体的生长分化,国际植物生理协会公布的植物激素包括：,作用：顶端分泌，诱导细胞分裂，促进生根。 用量：mg/L,（1）生长素(AUX)：,吲哚乙酸：IAA（indo acetic acid） 萘乙酸 ：NAA（naphthalene acetic acid） 吲哚丁酸：IBA（indolebutyr

14、i acid） 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 用法：溶于95%酒精或者NaOH,种类：,生长素作用强弱顺序：,2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根,No NAA,Poor shoot development and no roots. Extensive callus generation (1/5)NAA,Poor shoot development and no roots,NAA reduced to 0.1 mg. l-1,Growth medium is optimised for regene

15、ration of plantlets,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,NAA increased to 5.0 mg. l-1 Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus (10 xNAA),不同营养条件对植物组织培养的影响-AUX,种类： 6-BA(6-苄基腺嘌呤) Kt (

16、kinetin 激动素) Zt (zeatin 玉米素) TDZ（Thidiazuron ） 用法：溶于0.5 MHCl和NaOH,（2）细胞分裂素(CTK): 作用：根尖分泌，促进细胞分裂, 诱导芽的分化，延缓组织衰落。,Growth medium is optimised for regeneration of plantlets,The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface,不同营养条件对植物组织培养的影响-CTK,(1/5BAP ),G

17、A3： 作用：促进幼胚发育，促进细胞伸长，打破休眠。 用法：易溶于水，一般用95%的酒精配成母液贮存。,（3）赤霉素(GA),（4）乙烯,作用：催熟，促进植物落叶、早衰等，影响培养物的生长和分化。,（5）脱落酸,作用：促进脱落和衰老，在组培中或许促进，或许抑制愈伤的分化,作用：作用可能与CTK类似，但是用量远小于CTK。,（6）油菜素内酯,生长素促进DNA的复制 赤霉素促进G1-S,并缩短S期 细胞分裂素促进细胞质的分裂,琼脂是一种由海藻中提取的多糖类物质，本身并不提供任何营养，40 凝固。固体培养时最好的固化剂。 用量：0.7%-1%。,4 固化剂-琼脂,活性炭(active carbon)

18、： 活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。 通常使用浓度为 0.530g/L。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛及激素等。,5 其他成分,活性炭(active carbon)： 作用：利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响，防止褐变；利于生根。 浓度：530g/L。,5 其他成分,AgNO3: 作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现 浓度：1-10mg/L 抗生

19、素： 种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。 作用：可防止外植体内生菌污染。 浓度：520mg/L。,6、水 作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。 注意：用蒸馏水，最好是双蒸水,以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。 大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。,1、 母液(stock solution)的配制和保存 所谓母液是欲配制液的浓缩液。 意义: 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。,3.2 培养基的配制,化学药品及试剂 汉语名 分子式 生产公司 分子量 纯度 硝酸铵 NH4NO3 上海通亚精

20、细化工厂 80.04 分析纯 磷酸二氢钾 KH2PO4 中国江苏南京中山集团公司化工厂 136.09 硝酸钾 KNO3 上海鑫达精细化工有限公司 101.10 硫酸镁 MgSO4.7H2O 山东省化工研究院 246.47 氯化钙 CaCl2.2H2O (上海)四联化工厂 147.03 硫酸锰 MnSO4.4H2O 上海试剂工厂 169.02 硫酸锌 ZnSO4.7H2O 山东潍坊市试剂厂 287.54 硼酸 H3BO3 济南化学试剂厂 61.83 碘化钾 KI 上海化学采购站 166.064 钼酸钠 Na2MoO4.2H2O 北京五十六0一化工厂 241.95 分析纯 氯化钙 CaCl2.6H

21、2O 济南试剂总厂 237.93 五水硫酸铜 CuSO4.5H2O 济南化学试剂厂 249.68,汉语名 分子式 生产公司 分子量 纯度 乙二胺四乙酸钠 Na2-EDTA.2H2O 济南试剂总厂 372.24 分析纯 硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 山东博山化学试剂厂 278.01 分析纯 甘氨酸 C2H5NO2 中国科学院上海生物化学研究所 75.07 分析纯 盐酸吡哆醇 B6 C8H11O3N.HCl 中国医药上海化学试剂站 205.64 盐酸硫胺素B1 C12H17ClH4OS.HCl 中国新兴化工试剂研究所 337.27 烟酸B3 C6H5NO2 北京芳草医药化工研制公司 123.11

22、 化学纯 肌醇 C6H12O6 中国政翔化学试剂研究所 180.16 3-吲哚乙酸IAA（b-Indoleacetic acid） 天津天泰精细化工品有限公司 125.1 分析纯 萘乙酸 NAA C12H10O2 中国医药上海化学试剂公司 186.21 化学纯 叶酸 C19H19O6N7 上海化学试剂厂 441.42 2,4-D （2,4-dichlorophenoxyacetic acid ）上海雪满生物科技有限公司 6-BA（N6-benzylaminopurine） 上海伯奥生物科技有限公司 225.25 蔗糖 sucrose 天津市广成化学试剂有限公司 342.29 分析纯 琼脂 Ag

23、ar 国药集团化学试剂有限公司 B.R,单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml。 混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。 母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。,母液的配制方法：,MS培养基配制表,MS母液配制： MSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII铁 盐 200X MSIV有机 物 200X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/ml,植物激素母液的配制,生长素类： IAA、NAA、2，4-D、IBA 配制：先按要求称好100mg药品，置于小烧杯中，用0.1

24、N NaOH溶解，再用蒸馏水定容到1000mL，再于试剂瓶保存。则实验室NAA浓度为0.1mg/ml,细胞分裂素类： BA、KT、ZT 配制：先用0.5N盐酸溶解100mg药品，再用蒸馏水定容至1000mL，然后保存。则实验室BA浓度为0.1mg/ml,3.灭菌： 通常培养基应在汽相121摄氏度的条件下在高压灭菌锅内灭菌20 min。,在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到0.05 Mpa时，放一次气，然后在温度达121摄氏度时，保持此压力灭菌15-20 min。灭菌完成后，待灭菌锅的压力降到0时，打开灭菌锅，取出培养基，放平，待培养基凝固后备用。,灭菌后的培养基一般隔天再用，因pH变动 （偏酸0.1-0.3 pH ）。 培养基在低温暗中可保存一段时间（1个月）。,培养基的种类,（1） 基本培养基： 完全培养基：,培养基的种类,