进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法高效液相色谱串联质谱法编制说明

1、进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法作成说明一、任务来源本标准按照国家认证认可监督管理委员会颁发的河北出入境检验检疫局负责的行业标准修改任务。 这个标准名称是进出口动物源性食品中沃尼妙林及其同系物泰妙菌素残留量的测定方法 高效液相色谱串联质谱法，修订版号是2011b141。二、编制依据本标准是应gb/t 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规则、gb/t 20001.4-2001 标准编写规则 第4部分：化学分析方法、行业标准sn/t0001-1995 出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定 (

2、以下简称基本规定 )的要求制定的。三、研究背景中国蜂蜜出口消费地大多是日本、美国、欧盟等世界贸易组织和环境委员会的成员。 2002年，欧盟为氯霉素、连翘酯切耳类衍生物，是二萜类半合成抗生素，抗菌活性强，用于家畜感染性疾病的治疗，特别是对猪痢疾、猪拉肚子及霉菌体肺炎有很好的治疗和预防效果，故选用兽药和饲料添加剂但是，动物长期食用这种抗生素会在体内产生积累，而且有些饲养者为了单方面追求经济利益，会过量添加这种抗生素，使这种抗生素残留下来，然后这种抗生素通过食物链进入人体，对人类健康造成严重威胁7。 例如，长期食用留有泰坦的食品，可能会引起人肠道细菌菌群失调和结肠炎等危险8。 因此，世界各国对动物组

3、织及相关产品中的沃尼奇林和泰国伟大抗生素残留量做出了严格的限定。 例如，emea和我国都规定了时机和联合胺的最高残留量9 :肌肉中的时机为100g/kg，联合胺为50g/kg，肝脏中为500g/kg。 日本农林渔业部(maff )在动物肝脏、脂肪、肌肉组织中对沃尼妙林和泰国妙抗生素的最高残留量为0.04-6 mg/kg。我国是家畜的饲养、生产、消费和贸易大国，家畜肉出口市场主要集中在日本、韩国和欧盟等。 但是，中国的肉类在出口中超过药物残留标准而被拒绝进口国外的事件屡次发生。 另外，日本在06年提出了肯定列表制度，该制度大幅度提高了进口农产品食品的进入阈值。 因此，为有效控制泰霉素和黄芩苷的安

4、全使用，保证产品的食用安全，打破国外技术壁垒，保证产品的顺利出口，有必要建立动物来源食品中泰霉素和黄芩苷残留量的检测标准和方法。目前，关于这两种抗生素检测技术，主要有气相色谱(gc)10、高效液相色谱(hplc)11-14和高效液相色谱串联质谱联用(hplc-ms/ms )法15-23的gc法衍生化由于高效液相色谱串联质谱联用技术(hplc-ms/ms )因其操作简便、准确度高、灵敏度高、选择性强等优点成为各种兽药残留的实证方法，因此本文采用高效液相色谱串联质谱同时测定肉中泰霉素和黄芩苷的残留量考察了预处理条件和仪器测量残奥表，为此，本标准采用固相萃取技术净化样品，电离电喷雾，液相色谱串联质谱

5、(lc-ms/ms )检测，外标法定量，沃尼很棒四、方法概述(1)选择有代表性的5种常见的进出口动物来源食品(动物组织、内脏、鱼、蛋和乳)的基质进行研究，经过净化方法的选择试验、液相色谱串联质谱和实证条件试验，最终用乙腈提取样品中的波尼菲和茶碱， 用oasismcx spe柱净化的本方法科学合理，技术先进，便于国际对等技术交流，同时完全满足国外检验限量的需要。(2)本方法经过了回收率试验、精密度试验、方法验证试验。 结果表明，各项技术指标均完全满足检测需求。五、实验技术论证5.1样品预处理条件的选择5.1.1提取条件的选择文献报道16-19分别用三氯乙酸水(1 19，w:v )、乙酸乙酯和乙腈

6、作提取液，比较提取效果，结果显示乙腈提取效果高，且提取杂质少，可有效避免基质干扰。5.1.2净化条件的选择样品提取中的基质杂质显着抑制离子化效率，导致仪器灵敏度降低。 本实验采用乙腈萃取只能去除部分油脂和水溶性杂质，如果不用spe柱进行净化，质谱将产生较强的基质效应。 oasis mcx spe柱是一种新型混合型强阳离子交换、润湿性聚合物吸附剂，对碱性化合物具有高选择性和灵敏度。 本实验的对象物为弱碱性化合物，用5 %甲酸水溶液氧化后，以离子化的形式固定在强阳离子交换点，除去基质中的蛋白质和盐类，用纯甲醇和正己烷洗脱除去酸性和中性干扰物，最后用5 %氨水甲醇溶液洗脱目标碱性干扰物，制成疏水性碱

7、另外，实验比较了mcx(150mg，6ml )和mcx(60mg，3 ml ) 2种固相萃取柱的净化效果，结果表明，mcx(3ml，60mg )的固相萃取柱得到的回收率高。5.2测量条件的选择5.2.1液相条件的选择使用acquity beh c18 uplc柱，填充剂的粒径为1. 7m，与以往的液相柱相比，具有更高的灵敏度、更强的分离能力和更短的分析时间，能够在短时间内最大限度地高效地分离被测定物成分。 采用不同的洗脱梯度分别考察了波尼菲和三联苯的分离效果，降低流动相中乙腈的比例可以有效地分离两者，但同时导致灵敏度降低，最终选择了表1所示的梯度洗脱程序，得到了良好的分离度和灵敏度。 为了进一

8、步提高两者在正离子模式下的灵敏度和分离度，分别研究了在流动相中添加甲酸体积分率为0.05 %、0.1 %、0.2 %、0.5 %时的色谱灵敏度和分离度，结果表明，添加0.1 %甲酸水溶液时的被测物成分的分离效果和灵敏度最好。图1为优化条件下沃尼妙林和泰国妙抗生素的选择离子流图，其总保留时间为4.22min。 华尼妙林和泰国妙抗生素保留时间分别为2. 09、1. 98 min，分离效果良好，分析时间为4 min。最终选择液相色谱残奥仪。色谱柱： acquity uplc beh c18柱，(100 mm2.1 mm，1.7 m )； 流速：0.3ml/min； 试样注入量： 10l； 柱温： 3

9、0； 流动相：甲酸(1 999 )溶液(a )和乙腈(b )、梯度溶出、参考梯度条件如表1所示表1 .流动相溶出梯度表tab.1移动phaseelutiongradienttable时间/分钟流速/升/分钟a/%。b/%。03009550.830060402.330040602.43005954300595(a )(c )(b )图1华尼妙林和泰国妙抗生素的总离子流图和选择离子流图fig.1 mrmchromatogramofvalnemulinandtiamulin (a ) tic、(b) valnemulin (c) tiamulin5.2.2质量分析条件的优化根据连翘酯和连翘酯的结构特

10、征选择esi ()作为电离模式，分别取1.0mg/l的连翘酯标准溶液和连翘酯标准溶液，以5l/min的流速注入离子源，确定了定性、定量离子对，同时确定了团簇电压(dp )、聚焦由可知，泰霉素准分子离子m h为m/z 494.3，对其子离子进行全扫描，主要产生m/z 192.1、119.0的子离子的图2(b )的石墨烯的准分子离子m h为m/z 565.3 因此，沃尼妙林和泰妙菌的碎片离子可能的破坏方式如图3所示。 选择2个响应强的子离子作为监视器的碎片离子，将其中响应值高的子离子用于定量修正计算。(a )(b )图2离子模式下的沃尼妙林和泰国妙抗生素的扫描质量分析图fig.2 masspect

11、raofvalnemulinandtiamulininpositivemode (a )价值观(b ) tia mulin图3沃尼妙林和泰国妙抗生素碎片离子破坏方式fig.3 majorfragmentionsofvalnemulinandtiamulininpositivemode最终选择质量分析条件：离子源：电喷雾离子源电离方式：正离子模式检查方式：多反应监测(mrm )电喷雾电压(is):5 000 v； 雾化气体(neb )压力：0.5mpa； 气幕气体(cur )压力：0.35mpa； 辅助气体(aux )压力：0.7mpa； 辅助气体温度(tem):550； 冲击室出口电压(cxp

12、):13v； 聚焦电压(fp):150 v； 监测离子对、采集时间、保持时间、脱簇电压和碰撞能如表2所示。tab.2 esi-ms/msanalysisconditionsofvalnemulinandtiamulin化合物定性离子对/(m/z )定量离子对/(m/z )采集时间/(毫秒)保持时间/min脱簇电压dp/(v )碰撞能量ce/(v )泰特辛494.30/192.10494.30/192.10801.9823425494.30/119.0038沃尼妙林565.30/263.10565.30/263.10802.0910025565.30/285.20295. 3定量方式的选择外标法

13、定量：在仪器的最佳工作条件下，基质标准校准溶液的样品测定，基质标准校准溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对测定样品进行定量，样品溶液中被测物的响应值必须在仪器测定的线性范围内。六、方法的主要技术指标6.1线性范围和测量下限沃尼妙林的线性范围为1.0-200.0ug/kg，相关系数为r=0. 999 4，其回归方程为y=9.17105 x 11500，具有良好的线性关系，满足定量要求。 细胞嘧啶的线性范围为1.0-200.0ug/kg，相关系数为r=0. 999 8，其回归公式为y=7.04105 x 25800，具有良好的线性关系，满足定量要求。当茶碱和茶碱的

14、加入均为5.0ug/kg时，其信噪比均大于10，得到了良好的回收率和精密度，由此证实本标准烟曲霉菌的检测限于5.0ug/kg。6.2方法的回收率和精度用阴性鸡肉、鱼肉、猪肝、鸡蛋和牛奶样品进行添加回收和精密度试验，样品中添加不同浓度标准后，用本方法进行提取、净化和测定，各添加水平重复10次，沃尼妙林和泰国抗生素的添加量均为5.0、10.0、50.0和100.0 ug 4个添加水平的回收率在72.40%106.20 %之间，相对标准偏差在4.71%11.90%之间，方法的回收率和精度良好。6.3方法的验证结果本标准方法在5个实验室验证实验方法，实验结果如表5、表6所示。七.结论综上所述，本标准能

15、够满足动物组织、内脏、鱼、蛋和乳中沃尼奇林及其同系物泰国伟大抗生素残留量的测定分析。 方法：各项技术指标均符合基本规定的要求，可以满足进出口动物源性食品中沃尼好林及其同系物泰国好抗生素残留量的检验要求。表3鸡肉、鱼肉、猪肝、鸡蛋和牛奶样品中沃尼妙林添加回收率和精密度的实验数据鸡肉鱼肉猪肝鸡蛋牛奶添加值(g/kg )5105010051050100510501005105010051050100测定值(g/kg )4.128.9145.3494.674.039.2542.3688.654.679.2439.6687.244.269.2438.5689.244.878.2242.6381.264.078.3249.8990.544.578.7347.8282.763.768.2345.7385.363.788.5844.6986.353.929.4338.7484.394.038.7443.7395.323.749.5639.5293.753.899.3342.1594.713.879.6547.2594.363.837.8643.5577.883.877.8544.8587.214.637.8144.8990.234.217.4747.6382.334.678.21