乳酸菌检验操作规范培训.ppt

1、乳酸菌检验操作规范训练、质量控制部、目录、一、乳酸菌二、仪器设备三、培养基四、无菌室准备五、接种培养六、菌落数七、乳酸菌在改良MC培养基上的菌落特征八、过氧化氢酶试验、一、乳酸菌、一、乳酸菌的概念乳酸菌一乳酸细菌的类群多称为乳酸菌。 2、乳酸菌主要分布在乳杆菌属、链球菌属、明珠菌属、单球菌属、双歧杆菌属的革兰氏染色阳性，其特征在于，在2乳杆菌属的生物学特征、化能异养型、营养要求严格，生长繁殖需要多种氨基酸、维生素、肽、核酸衍生物。 最适合厌氧、耐酸性厌氧或兼性厌氧生长的pH为5.56.2，在pH为5的环境下可以生长，但在中性或初期碱条件下生长速度降低。 生长温度范围，253，最佳生长温度304

2、0。 3乳杆菌属的代表种，3.1保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus )细胞形态为长棒状，两端钝圆。 生长在固体培养基上的菌落呈棉花状，容易与其他乳酸菌区别。 利用葡萄糖、果糖、乳糖进行同型乳酸发酵可以制备d型乳酸(有酸味，适口性差)，不能利用蔗糖。 是乳酸菌中酸能力最强的菌种。 蛋白质分解力弱，发酵乳中产生香气物质乙醛。 最佳生长温度3745，高于或低于温度50不生长。 常被用作发酵酸奶的生产菌。 3.2嗜酸乳杆菌(L.acidophilus )细胞形态小于保加利亚乳杆菌，呈细长棒状，可利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖进行同型乳酸发酵生成乳酸。 最佳生长温度37、20以下不生长，耐热性差。

3、蛋白质的分解力弱。 使pH 5.56.0最佳生长，可在耐酸性强、其他乳酸菌不能生长的酸性环境下生长繁殖。 嗜酸乳杆菌是能定植在人体肠道的少数有益微生物菌群之一，其代谢产物有机酸和抗菌物质乳杆菌能抑制病原菌和腐败菌的生长。 (二)链球菌属(Streptococcus )、1链球菌属的形态特征细胞呈球形或卵圆形，并排成对或对链。 革兰氏染色阳性，无芽胞，一般不运动，不产生色素。 2链球菌属生物学特征，化能异养型，同型乳酸发酵产右旋乳酸兼性厌氧型，接触酶反应阴性，厌氧培养生长良好。 3链球菌属的代表种，嗜热链球菌(St.thermophilus )细胞形态呈链球状。 用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖发酵可

4、以生成乳酸。 蛋白质分解力弱，发酵乳中可产生香味物质双乙酰。 该菌的主要特征是在高温条件下能产酸，在最佳生长温度4045、温度不到20时不产酸。 耐热性强，能承受6568的高温。 (三)明珠菌属(Leuconostoc )，菌落一般不足1.0mm，为光滑、圆形、灰白色细胞的球形或豆状，成对或对链排列。 革兰氏染色阳性，不运动，无芽胞。 (四)双歧杆菌属、1歧杆菌属形态特征细胞呈多种形态： y字型、v字型、弯曲状、勺型，典型形态为分支杆菌革兰氏染色阳性、亚甲蓝染色菌着色不规则。 没有芽胞也没有鞭毛，不运动。 双歧杆菌属生物学特征、化能异养型、营养要求严格，生长繁殖需要多种双歧因子。 利用葡萄糖、

5、果糖、乳糖和半乳糖可以生成乳酸、醋酸和少量甲酸和琥珀酸。 蛋白质的分解力弱。 特异性是厌氧的，但不同菌种和菌株对氧的敏感性有差异，多次传代培养后，菌株的耐缺氧性增强。 生长温度范围2545，最佳生长温度37。生长pH范围为4.58.5，最佳生长起始pH为6.57.0，不耐酸，酸性环境(pH5.5)不利于菌体生存。 3、代表种、人体肠道共8种，其中最多5种为双歧杆菌(B.bifidum )婴儿双歧杆菌(B.infantis )青春双歧杆菌(B.adolescentis )，在宿主肠黏膜形成生物学屏障拮抗病原菌，微生态玫瑰具有提供营养、抗肿瘤、降低内毒素、提高免疫力、保护造血器官、降低胆固醇水平等

6、重要生理功能，促进人体健康的有益作用远高于其他乳酸菌。 二、检验仪器设备、冰箱： 04恒温孵化器： 361恒温水浴锅： 461微生物显微镜柜药物天平：0g500g，精确三角瓶： 500ml灭菌刻度吸管：1ml，10ml灭菌平盘：直径90mm牛肉精华，5g； 酵母提取物，5g； 葡萄糖，20g； 乳糖、20g； 碳酸钙，10g； 琼脂，15克； 蒸馏水，1000mL； 1的中性红溶液，5mL； 硫酸多粘菌b，10万IU。 11515分高压灭菌备用。 2、培养基准备使用前，灭菌培养基用微波炉或水浴锅加热溶解，在4045水浴中保温待机。 四、无菌室的准备、无菌室的使用前后，用紫外灯照射3040分钟。

7、 将工作服、工作帽和工作鞋放入无菌室进行灭菌，在进入无菌室之前更换工作服、工作帽和工作鞋。 洁净工作台在使用前用75%酒精擦拭消毒后，用紫外灯照射4045min，操作结束后，用洁净片擦拭工作台面后，用75%酒精棉球擦拭，点上紫外灯照射4045min。 五、接种培养，无菌操作下，用1ml灭菌刻度吸引管吸引1ml样品原液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，充分摇匀，制成1:10的稀释液。 注意：刻度吸管前端不得接触试管内的生理盐水。 用1ml灭菌刻度的吸引管吸引1 ml 1336010的稀释液，注入含有灭菌生理盐水的试管内，摇动试管均匀混合。 注意：吸取稀释液之前，请用刻度吸管吹走，使稀释混合均匀。

8、刻度吸管的前端请勿接触管内稀释液。 另取1ml的灭菌刻度吸引管，按照上述操作步骤，制作10倍增稀释液，这样每增加1次，更换1根1ml的灭菌刻度吸引管。 在无菌操作条件下，用1ml灭菌刻度吸引管将所选择的样品稀释液或原液吸引到灭菌平盘内。 对相同的样品重复相同的操作。 即，为每个选择的适当样品稀释液制作两个平盘。 按照以上的顺序，将灭菌生理盐水1ml作为空白操作进行对照。 在无菌操作条件下，将约15ml的改良MC培养基装入样品板上，将板放置在操作台上轻轻转动，使样品和培养基混合均匀。接种培养操作视频检测乳酸菌. MPG，讨论、视频存在细小问题： 1、持平板前双手2消毒，倒培养基前对培养基瓶消毒，可酒精棉球消毒和酒精灯外炎消毒。 等到培养基凝固后，翻转平盘，即使有培养基的面朝上。 将所有平皿放入361培养箱中培养723h，观察乳酸菌菌落特点。选择菌落计数、菌落数在30300之间的平皿进行计数。 修订后随机取5个菌落进行革兰染色，进行显微镜检查和过氧化氢酶试验。 革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、无芽胞的球菌和杆菌可以是乳酸菌。 由确认为乳酸菌的菌落算出该皿内的乳酸菌数，乘以其稀释倍数，得到每1毫升样品中的乳酸菌数。 例如，检体10-4的稀释液在改良MC平板上生成35个可疑菌落