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1、引物设计的一般原则郭大伟，引物设计的一般原则，1。引物长度7。发卡结构2。GC% 8。二聚体3。Tm值9。4.3级碱要求10。交叉二量5.5级碱要求11。产品长度6。g值12.引物太短，同时会引起错误的匹配现象。一般需要引物长度大于16bp的(不容易拼错)。例如，一个12bp长的引物在人类基因组(3 x 109/412=200)上有200个潜在退化部位。一个20bp长的引物在人类基因组中存在的退化部位只有1/400个。长引物(28-35bp)一般用于区分，上游和下游引物GC含量不能大不相同。Tm值，Tm DNA溶解温度，即DNA双链失去一半时的温度。Tm值计算的经验公式Tm=4 (G C) 2

2、(A T)退火温度通常低于Tm，退火温度越高，特异性越高，但杂交率低。PCR退火温度一般在55，变性温度94，Tm一般在58-70之间合适。两个引物之间的Tm值应尽可能接近，渡边杏超过4，3段碱基要求，引物3段的最后碱基对Taq酶的DNA合成效率有很大影响。徐璐在其他最后一个碱基错误配对的位置徐璐导致其他扩增效率，最后一个碱基A的错误配对效率远高于其他三个碱基，因此要避免在引物第三段使用碱基A。引物序列在模板中必须具有很高的相似性。特别是三段相似度高的序列，否则容易出现错误的搭配。如果引物3段出现GGG、CCC等3个以上连续碱基，出错的可能性也提高，3段碱基要求、5段碱基要求、5段序列对PCR

3、的影响不大，经常用于引入受精部位或标记物。G值，G值表示DNA双链形成所需的自由能，牙齿值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。3结束G值低(绝对值不超过9)、5结束和中间G值相对高的引物。引物3段G值太高，在错误的位置形成双链结构，容易引起DNA聚合反应。(价值越高，容易结合)G高于4.5，容易产生引物共聚物和发夹结构。发夹结构，Hairpin在引物自身碱基之间配对，二聚体，Dimer在同一引物两个连接之间发生碱基互补配对，错误配对，Fals priming引物，模板配对的位置不止一个。只有一个引物可以完全匹配，但是其他位置也可能在引物之间发生不完整的对，从而影响扩展。交叉二聚体，Cross dimer两个引物之间发生碱基对，产品长度，产品根据

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