流式细胞仪原理及应用

1、致：,流式细胞术概述,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量,流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 ,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内/外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化 pH值 钙离子

2、浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位 ,流式细胞仪的原理,液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。,光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号,电子系统：荧光信号和散射光信号经二极管和PMT接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器转换为可被计算机识别的数字信号，以图形的形式呈现给操作者,散射光信号,散射光信号,Right Angle Light Detector Cel

3、l Complexity SSC,Forward Light Detector Cell Surface Area FSC,Incident Light Source,前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC, Side Scatter） 细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,流式细胞仪的检测信号,荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光信号,双色直接染色,数据存储,FCS 2.0格式 常以列表模式（LIST MODE)：将每个细

4、胞的每个检测参量依次排列顺序存储,FITC/PE双染样本,数据显示,直方图（Histogram） 二维点图（Dot Plot） 等高线图（Contour Plot） 密度图（Density） 三维图（3D Plot）等,单参数直方图分析,数据分析,直方图分析,多参数散点图分析,数据分析,等高图和密度图分析,数据分析,三维图分析,流式细胞仪的应用,流式细胞仪的临床应用,HIV免疫分型，CD4绝对计数 淋巴细胞亚群分析 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的免疫状态监测 干细胞计数 阵发性血红蛋白尿 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病,流式细胞仪的科研

5、应用,免疫功能研究 血小板分析（心脑血管疾病） 细胞周期和倍体分析 细胞凋亡 干细胞研究 树突细胞研究 肿瘤相关基因表达的研究 抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究 放疗/化疗疗效的研究,淋巴细胞亚群分析,使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（CD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析 各淋巴细胞亚群的百分含量 淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析,淋巴细胞亚群分析,根据功能，淋巴细胞主要分为 B淋巴细胞（CD19+），与体液免疫有关 T淋巴细胞（CD3+），与细胞免疫有关 总T和总B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 N

6、K细胞（CD3-CD16+56+），行使免疫监控功能， 能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。,淋巴细胞亚群分析,根据CD4、CD8表达，T淋巴细胞又分为 T辅助/诱导细胞（CD3+CD4+） T抑制/细胞毒性细胞（CD3+CD8+） Th/Ts 评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无 r 球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如AIDS） 造血干细胞移植后免疫重建（6个月NK；9个月T、B） Th/Ts：机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常） Th/Ts：机体免疫功能低下：A

7、IDS、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等 移植后动态免疫监测： 急排临床症状出现前1-5天，活化T和Th/Ts持续，1.2预示急排； Th/Ts持续表明可能感染，比值1.08，可能性大，0.2应停用免疫抑制剂； 实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察 治疗前常伴T 、Th/Ts，放/化疗有效可恢复； 淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好； 探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）,临床意义判断病人的机体免疫状态,常见疾病的T 淋巴细胞的变化：, CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 类风湿性关节炎 （活动期） 系统性红斑狼疮 - 或 （活动期） 多发性硬化症

8、 重症肌无力 膜型肾小球肾炎 胰岛素依赖性糖尿病 乙型肝炎 自身溶血性贫血 上呼吸道感染 ,常见疾病的T 淋巴细胞的变化,CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ 肿瘤 再障及粒细胞减少症 巨细胞病毒感染 血小板减少 活动性特应性皮炎 过敏性皮炎 ,淋巴细胞亚群双色分析,12%,76%,49%,26%,11%,AIDS 病人T亚群分析,27-51%,15-44%,50-84%,先天性无 r 球蛋白血症,5-18%,乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化,TriTEST/MultiTest与T淋巴细胞绝对计数,使用三色试剂或四色免洗试剂 样本使用EDTA抗凝全血，用血量50uL 免洗操作，减少细胞

9、丢失 绝对计数TruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度单平台计数 报告T淋巴细胞及TH、TS百分含量、绝对含量和H/S比值,TriTEST CD4/CD8/CD3分析与T淋巴细胞绝对计数,%T LymphCD3+ Abs Cnt CD3+CD4+ %T LymphCD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+ %T LymphCD3+CD8+ Abs Cnt T H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,淋巴细胞活化功能研

10、究,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖 细胞表面表达活化标记 分泌细胞因子,CFSE示踪原理,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析。 体内、体外实验均可以应用,Dilution of CFSE with cell division,Lyons and Parish, 1994 JIM, 17

11、1;131,Divisions: 3 2 1 0,CFSEFL-1 (Log),Divisions: 3 2 1 0,葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图，,T淋巴细胞活化,细胞数目增殖 细胞表面表达活化标记 分泌细胞因子,T细胞激活抗原表达的动力学曲线,FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,BD FastImmune Activation System快速免疫活化检测系统,HIV病程进展,应用实例：HIV病例T细胞活化检测,淋巴细胞活化功能检测的广泛应用,结合淋巴细胞亚群分析

12、免疫调节: 病因学研究: AIDS、感染、肿瘤、自身免疫性疾病 药物筛选/疫苗疗效评价 各种状态下免疫状态评价：移植、寄生虫、营养失调、创伤、手术、烧伤、放/化疗等,T细胞的细胞因子分型,型介导细胞免疫反应 引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调 刺激来源：病毒、某些细菌 型介导体液免疫反应 引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调 刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源,细胞因子相关的主要研究领域,肿瘤 肾炎 感染 自身免疫病 超敏反应 移植排斥反应 免疫缺陷病 血液疾病,活化的淋巴细胞分泌细胞因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,

13、Activation 37 Incubation,Intracellular Stain,Lyse/Fix,Acqusition,Permeabilize,lymphocyte,erythrocyte,stimulus,Surface Stain,Wash,cytokine,Wash,Wash,protein blocking,基于细胞水平的研究 胞内因子 胞外因子,BD FastImmune Cytokine System快速免疫细胞因子检测系统,应用实例：分析1型与2型免疫反应,分析结核菌感染12周后用PBS (a), PPD-B (b), BCG（卡介苗） (c), or M. bovi

14、s (d)分别刺激的结果。B结果,CytometricBeads Array (CBA)系统胞外细胞因子检测系统,简介,CBA是一系列荧光强度不同、包被有捕获抗体的微球，类似于ELISA的捕获孔板，可以捕获相应的抗原，再结合第二种荧光检测抗体，形成一种双抗体夹心结构，能结合上，就能发出荧光来，从而检测到相应的抗原。 简而言之，将包被有不同抗体的微球混合在一个样本中即可进行多参数检测。 应用领域：主要用于血清、血浆、培养细胞上清、眼泪或房水等各种液相中可溶性细胞因子的浓度检测 细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析,How to analyze soluble proteins in FCM

15、?,+,+,待分析的可溶性抗原,荧光标记的检测抗体,捕获微球,捕获抗体,Bead,微球体标记技术&FCM,技术基 本 原 理,CBA,捕获微球可溶性抗原检测抗体 三明治复合物,Cytometric Bead Array multiplexed beads,1,2,3,不同强度红色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测,不同的目标蛋白,PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。 荧光强度即为靶蛋白量,4,7,5,6,Human Th1/Th2 Cytokine CBA Kit,No sample added in Detector antibodies only,Chemokine-I CBA

16、Assay Standard,0 pg/ml,CBA Assay Standard,10 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,20 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,80 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,156 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standa

17、rd,312 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,625 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,1250 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,2500 pg/ml,CBA Assay Standard cont.,Chemokine-I CBA Assay Standard,Human Th1/Th2 Lymphokine CBA 标准

18、曲线,5000 pg/ml,2500 pg/ml,1250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,80 pg/ml,20 pg/ml,IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF- IFN-,IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF- IFN-,操作步骤,检测物与捕获微球共孵育。 洗涤。 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记）。 洗涤。 流式细胞仪上机检测。 CBA分析软件批量数据分析。,与传统的ELISAs检测相比,能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测 较传统检测节省样本量（50l） 与ELISAs相比灵敏度高（2.8pg/ml）、重复性好 检测的线性范围宽（0-

19、5000pg/ml） 所有分析只需一组标准曲线 避免酶联反应所致人工假象 强大的CBA分析软件 节省操作时间、检测时间和分析时间,。 。,BD CBA新产品系列BD CBA Flex Set-New,基本原理与CBA Kit相似 检测原理不同： Flex Set微球种荧光，分别在流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色荧光）通道检测，通带有近红外和红色两过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。,CBA Kit与CBA Flex Set,CBA Kit 同时检测5或者6个 全部试剂 CBA Analysis S

20、oftware 检测指标组合固定,CBA Flex Set 最多达75个 需另购Buffer kit FCAP Array Software 检测指标可自由组合,CBA/CBA Flex set的应用领域,血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测 细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析 免疫细胞功能性研究 免疫疾病的监控 疫苗研发，药效评价，总体免疫功能分析 传染性疾病 肿瘤研究,HLA-B27分析,HLA-B27, HLA-B27是MHC I类抗原，在有核细胞上广泛表达 HLA-B27的表达与强直性脊柱炎高度相关，在其它血清阴性骨关节病、银屑病性关节炎、葡萄膜炎等也有明显表达

21、 使用流式细胞仪，可以快速、灵敏、准确地分析HLA-B27 BD HLA-B27 Kit检测HLA-B27，报告检测的平均荧光强度，根据界值判定，得到阴性/阳性结果。实验的灵敏度为100%，特异性为97.5%,HLA-B27,HLA-B27阴性样本,HLA-B27阳性样本,流式细胞仪的应用（血液）,白血病和淋巴瘤免疫分型 残留白血病 造血干细胞计数 网织红细胞的分析 阵发性血红蛋白尿（PNH）诊断 血小板分析 血小板膜糖蛋白分子的表达 血小板活化 网织血小板分析 血小板自身抗体检测 网织血小板计数,白血病免疫分型,FAB分型：AL分为AML（M0-M7）& ALL 白血病的MICM分型 Mor

22、phology Immunology Cytogenetics Moleculor Genetics 白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。,白血病细胞特性：,白血病细胞的异常表现在抗原系列异常和时间异常 异常抗原表达(Aberration Antigen Expression) 丧失系列规律性（lineage infidelity) 过高，过低，不表达， 交叉 丧失分化发育的阶段性（differentiation asynchrony) 早期

23、与晚期抗原同表达,白血病免疫分型抗原,常用白血病细胞系列与分化阶段抗原,白血病细胞系列非特异性抗原： 干/祖细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38- 原始细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38+ 幼稚细胞：CD34-、HLA-DR-、CD38+）,白细胞共同抗原：CD45,CD45的临床应用,CD45是白细胞的共同抗原成分。其分子量介于180220Kda之间，属于T200家族。所有人类白细胞均表达CD45，包括淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞、胸腺细胞、脾细胞、扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞。造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即分化程度高的细胞CD45

24、表达量高，分化程度低的细胞CD45表达量低（淋巴细胞单核细胞成熟粒细胞原幼细胞，在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞单核细胞原幼细胞淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45SSC设门（Gating），可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性,CD45的临床应用,用CD45-SSC设门寻找异常细胞，将细胞分为5个群体，当幼稚细胞达70-80%时，即可大致估计AL的类型。骨髓成分复杂，各种大小和分化程度的细胞均有，若不用CD45-SSC设门，我们检测到的阳性细胞的百分率是以总细胞为分母来计算，当时以阳性细胞大于20%为界线，现在以CD45-SSC

25、设门，排除了正常细胞的干扰，阳性细胞的百分率是以幼稚细胞为分母，因此再以阳性细胞20%作界线则不太合适了，所以，用CD45-SSC设门寻找异常细胞时，以定性比定量更重要。,正常人血液白细胞免疫表型散点图,正常人血液细胞免疫表型,T淋巴细胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部分细胞CD（16+56）+，无CD4+CD8+双阳性细胞 B淋巴细胞：CD45+、CD10-/CD19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13- NK细胞：CD45+ 、CD（16+56）+/CD3- 单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+

26、 中性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高 嗜酸性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,正常人骨髓细胞免疫表型,淋巴细胞:CD45+、CD34-/CD38+、CD5+/CD7+（T淋巴细胞）；CD10-/CD19（B淋巴细胞） 单核细胞:CD45+,CD34-/CD38+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+、CD36+/GlyA- 粒系细胞: 原粒细胞CD45+、CD34+/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR

27、+/CD13+ 早幼粒细胞及其以下各阶段中性粒细胞：CD45+、CD34-/CD38+、CD14-/CD33+、HLA-DR-/CD13+，与原粒细胞或更幼稚细胞的表型有明显差异 巨核细胞：CD45+、CD41+/CD61+ 幼红细胞：CD45-、CD36+/GlyA+,T-ALL免疫表型,B-ALL免疫表型,HL,A,-,DR,CD19,CD10,CD20,CD22,CD79,a,其它,早期前,B,-,ALL,+,+,-,-,C,+,/M,-,+,34/38,+,普通型ALL,+,+,+,-,C,-,/M,+,34/38,前,B,-,ALL,+,+,+,+,B,-,ALL,+,+,-,+,+

28、,+,Kappa,+,/,Lambda,+,*,CD10,+,的,ALL,疗效好，有,CD34,+,病人往往合并,t(9,22),需强化治疗,成熟,AML免疫表型,急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,FCM在临床血液学中的应用,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型 能正确鉴别AML中难于鉴别的M0、M6、M7 诊断双系或双表型白血病 发现仅表达个别次要非本系列相关抗原的白血病 诊断少见疑难白血病（如HCL）,免疫分型 对下列情况具有重要意义,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的白

29、血病。 形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记。 混合性白血病。 部分髓系白血病。目前，免疫分型对粒-单核细胞和单核细胞白血病的鉴别尚有一定困难。 慢性淋巴细胞白血病。 微小残留白血病。,阵发性血红蛋白尿PNH,阵发性血红蛋白尿是由于红细胞膜的获得性缺陷，对激活补体异常敏感的一种慢性血管内溶血 患者体内红细胞呈不均一性 利用流式细胞术和CD55和CD59单克隆抗体，对PNH患者红细胞、粒细胞和血小板进行分析，证实存在膜蛋白表达缺陷的血细胞，并计算缺陷细胞在全血中所占比例,阵发性血红蛋白尿PNH,正常人红细胞、粒细胞和血小板CD59表达完

30、全阳性 PNH患者血细胞分为三型： 型：CD59表达完全阳性，荧光强度与正常人阳性峰荧光强度接近 型：CD59表达部分阳性，荧光强度介于型与型之间 型：CD59表达完全阴性 分析PNH患者各型细胞所占百分比，评估疾病的严重程度,红细胞 PNH分析,A 正常人 B D 病人,网织红细胞计数Retic-COUNT,操作快速、简便 计数精确 低水平网织红细胞检测 网织红细胞成熟指数IRF,临床应用： 预测骨髓移植效果 判断贫血发病原因 评价生物制剂的疗效,网织血小板的检测,人们最先于1969年指出网织血小板是一类能被新亚甲蓝深染的血小板。如网织红细胞一样它们是代表了新生的血小板。以后的二十年中，人们

31、发现网织血小板为骨髓新释放的未成熟成分，含有大量的RNA，因此，外周血中网织血小板的多少，可以间接反映骨髓巨核系造血的活跃程度。并能用常规的检测网织红细胞的噻唑橙（TO）等核酸染料染色。在流式细胞仪上方便、准确地检测。,临床应用,正常人网织红细胞1.07% 缺铁性贫血（IDA )4.78%,临床应用,再障（AA)0.03% 溶血性贫血（HA)29.33%,造血干细胞计数,造血干细胞是一群有一定增生能力，可以多向分化的造血细胞。 造血干细胞的特征是： 大小（FSC）和颗粒度（SSC）介于成熟淋巴细胞、大淋巴细胞相似 细胞内含有较多核酸物质 CD34表达弱阳性或强阳性 CD45表达弱阳性 在干细胞

32、移植时需要做造血干细胞绝对计数,造血干细胞计数,干细胞移植应用,血液系统病症: L&L , 再生障碍想贫血 恶性肿瘤:乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌 遗传性异常病变 免疫缺陷:血红蛋白病,血小板检测,血小板膜糖蛋白复合物诊断血小板缺陷性疾病 CD41-CD61复合物：血小板无力症 CD42a-CD42b 复合物：巨大血小板症 血小板活化的相关检查 血小板颗粒膜糖蛋白，如CD62，CD63 血小板膜糖蛋白活化表位，如PAC-1 血小板减少性疾病 血小板自身抗体检测 网织血小板的检测 血小板脱落微粒的检测,血小板活化,IIb/IIIa复合物（CD41/CD61）在所有静止和活化的血小板上都有表达

33、 血小板活化时发生的改变 IIb/IIIa复合物发生变构，表达PAC-1 血小板内颗粒释放，分泌促进凝血反应的物质，这时表达CD62P,CD61圈血小板门 PAC-1/1：阴性对照，静止的血小板 PAC-1/CD62P：试验管，ADP刺激下活化的血小板，报告血小板活化百分含量,血小板活化,血小板活化,直接测量循环血小板活化状态与反应性 可直接测定凝血酶等诱导剂活化的血小板 血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药物的影响，预测血栓形成 心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关 预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性 缺血性脑血管病与血小板活化有关

34、子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加 抗血小板治疗疗效监测,脑栓塞病人血小板活化检测,A CD61-SSC设分析门 B 阴性对照 C 治疗前 PAC-I 27.74% CD62P 15.86% D 溶栓后 PAC-I 9.13% CD62P 4.12%,血小板无力症（CD41缺陷，PAC-I下调）,巨血小板症,蓝阴性对照 绿正常人 红病人 CD41表达上调 CD42a/CD42b缺失,血小板自身抗体 ITP病人,DNA细胞周期分析,细胞周期,G2,M,G0,G1,s,0,200,400,600,800,1000,s,DNA分析,DNA含量,细胞数量,DNA细胞周期分析参数,DNA倍体性P

35、loidy 细胞内染色体DNA含量 二倍体Diploid 正常体细胞内染色体DNA含量 DNA指数（DI） 测定标本的G0/G1期细胞DNA含量 与同种系正常细胞的G0/G1期细胞 DNA含量的比值，表示细胞倍体性 S期含量SPF S期细胞占总周期细胞的比例 增殖指数PI 增殖细胞占总周期细胞的比例 CV G0/G1期细胞DNA含量变异系数,DNA分析的临床意义,DNA分析诊断肿瘤 DNA非整倍体细胞峰或突出的四倍体细胞峰 S期细胞含量10-15% DNA倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，提高治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液

36、、灌洗液脱落细胞的分析，意义尤为重要。 研究各期细胞比率与肿瘤组织分级的关系。 提示肿瘤患者预后。 增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性，判断临床治疗方法的疗效或用于探讨新药新方法的作用机理和疗效。,FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用,DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在淋巴瘤（L&L）病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标,FCM参数的预后意义,DNA及倍体分析在某些肿瘤有预后价值： 膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜

37、癌、皮肤黑色素瘤 S期比率与肿瘤组织学分级密切相关： 肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤,细胞凋亡PI分析,PI - Fluorescence,# Events,凋亡细胞,正常G0/G1期细胞,128,正常DNA倍体分析,129,Aneuploid peak,DNA异倍体,秋水仙素处理罗田甜柿获得12 倍体再生植株,正常人骨髓细胞DNA周期分析（ModFIT）,132,肿瘤细胞SPF(S期含量),肿瘤细胞(单克隆) (14.18%),正常骨髓细胞 (2.93%),肿瘤细胞(多克隆) (28.52%),乳腺癌及乳腺良性病变的流式检测对比分析,细胞凋亡,

38、细胞凋亡的分析,细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋亡的主要检查手段 形态学检查 DNA Ladders实验 流式细胞仪检查 与凋亡相关的病理过程（HIV、自身免疫性疾病、肿瘤） 研究凋亡调控因素如癌基因、细胞因子及药物等对凋亡的影响,凋亡检测-每一步都有检测试剂盒,细胞凋亡检测,凋亡相关细胞膜变化的检测 凋亡相关线粒体变化的检测 凋亡相关酶活性的检测 凋亡相关DNA片段的检测 凋亡相关基因蛋白的检测,细胞膜变化的检测早期凋亡,磷脂酰丝氨酸（PS）外翻，DNA不断裂 线粒体膜电位变化的检测 细胞内氧化还原状态改变的检测,细胞膜变化的检测,磷脂酰丝氨酸（PS）的检测早期凋亡,早期凋亡PS检

39、测及结果判断,早期凋亡特征 磷脂膜（PS）外翻，但是细胞膜保持完整性，因此PI染色为阴性 DNA没有发生断裂 结果判定 早期凋亡：AnnexinV+/PI- 死亡或者晚期凋亡： AnnexinV+/PI+ 正常的活细胞： AnnexinV-/PI-,ANNEXIN-V/PI检测,142,ANNEXIN-V/PI检测,control,处理16h后,处理24h后,线粒体水平检测相关产品,线粒体膜电位的检测 BD Mitoscreen（JC-1）Cat# 551302 25tests 原理：荧光染料JC-1在活细胞中以聚体形式存在于线粒体基质上产生红色荧光，在凋亡细胞中，以单体形式存在不与线粒体结合

40、而产生绿色荧光。 操作简单，试剂直接加入细胞中，20分钟后检测,JC-1 检测结果流式图,凋亡相关酶活性的检测,背景知识 细胞凋亡过程中，胞内主要蛋白通常被降解，调节这一过程的蛋白叫Caspase（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶） Caspase 3是参与DNA维护和调控细胞的组分裂解 Caspase 3激活=细胞凋亡 检测原理：是通过特异性抗体检测全长或者剪切后的caspase活性。,CBA分析凋亡信号通路,DETECTOR ANTIBODY,LYSATE OR SUPERNATANT,BEADS,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Wa

41、sh,Read on Flow Cytometer,Active Caspase-3,Bcl-2,Cleaved PARP,一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本和检测抗体孵育后，形成“三明治”复合物,Active Caspase-3,Bcl-2,Cleaved PARP,Bcl-2、Caspase-3、PARP构成的凋亡调控通道主要蛋白，对于凋亡研究具有特殊的意义(CBA Human apoptosis kit 557816),流式检测活性Caspase-3,相关产品：Active Caspase-3 Apoptosis kit（550914），包含了 固定破膜液，洗涤液和

42、PE标记抗体； 特点：细胞需要固定破膜，然后才能染色,149,化疗前后胃癌活检标本中Caspase-3+细胞,化疗前(3.49%),化疗后(94.86%),DNA水平的凋亡检测-晚期检测,凋亡晚期 DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成185bp为基数的有序片段 检测方法 Tunel流式法，通过在核酸片段末端标记，跟传统相比优点在于可以计算凋亡百分比 DNA Ladder分析，但凋亡细胞太少时作不到,TUNEL简介,通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP （多为dUTP）接到DNA片段的3-OH端，再通过荧光检测定量分析结果。,TUNEL（Terminal deoxynu

43、cleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）,152,DNA断裂点检测,TUNEL法流式分析凋亡结果,154,BrdU-FITC/PI检测,S期,凋亡检测总结,检测水平 细胞 核酸 细胞膜 胞内通路 线粒体,微生物,微生物,细菌的计数 检测与鉴定（CBA) 血清血诊断(CBA) 抗生素敏感性实验,细胞活力检测（细菌活力）,图 流式细胞术分析GFP转染效率和表达量,调节性T细胞研究进展,免疫耐受机制,以往研究认为：（“被动”方式） 胸腺细胞及前B（pre-B）细胞在中枢免疫器官中的克隆清除 进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识

44、别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自身反应性 部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视,免疫耐受机制,近年研究表明 ： （“主动”方式） 调节性T（Tr）细胞以“主动”的方式维持自身免疫耐受,这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响。,调节性T细胞的特异性标志,FOXP3（Forkhead box protein P3）是一个50kD的转录因子，也称为Scurfin、JM2、IPEX。它是一个主要调节基因 。 CD4+/CD25-细胞上FOXP3的转录表达可以诱导GITR、CD103和CTLA4的表达，并且促使调节性T细胞表型形成。 FOXP3

45、在X连锁自身免疫过敏失调综合征（XLAAD或IPEX）患者中发生突变。 FOXP3过度表达会引起机体的免疫应答下降，表明它是一个调节T细胞活性的主要转录因子。 FOXP3表达于细胞内,调节性T细胞分类,根据来源、特异性及效应机制可分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞 天然性调节性T细胞：在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有510的细胞持续高表达CD25分子，该群细胞从胸腺中发育，组成性表达foxp3，在体内外发挥免疫调节功能 获得性调节性T细胞：是由外周T细胞在特定的条件下分化出来，通过分泌高水平的IL-10和 TGF-而发挥其抑制功能.,Regulatory T Cells Background:its Development,Thymus,Periphery,T cell precursor,Tr1,Th3,FoxP3-,?,iDC and/or in the Presence of IL-10 And/or TGFb,Conventional T cell,Nave T cell,Naturally occurring Treg cell,Adaptive Treg cell,CD25,GITR