食品生物技术第一章发酵工程.ppt

1、第一章 发酵工程,生物技术与发酵工程,上游工程,下游工程,1.1发酵工程概况,一、发展简史 发酵技术的发展是一个从自然发生的由微生物起主导作用的生物化学反应演变到能够人为控制的生物化学反应工程。 与现代发酵工程相比，区别主要体现为是否纯种发酵，是否具有过程控制，是否运用现代化的生物反应器等。,发酵工程的发展的5个阶段 1 天然发酵时代(自然发酵阶段1900年以前) 发酵技术：古老的酿造食品工业，如：啤酒、葡萄酒、黄酒、酱油、醋、腐乳以及干酪等的制造。 特点：不清楚微生物与发酵的关系，单凭经验产业。 2纯培养技术的建立（纯培养发酵阶段1900-1940年） 17世纪荷兰吕文霍克用显微镜观察到微生

2、物，1860年，法国的巴斯德，在酵母人工培养过程，发现发酵是由微生物造成的。 到第1次世界大战，Weizmann建立起来的丙酮丁醇发酵技术是第一个纯种发酵。 特点：生产过程简单，规模小，产品简单多为初级代谢产物。,3. 液体深层通风搅拌发酵技术的建立（液体深层通风发酵阶段1940-1957年） 1929年，A.Fleming发现青霉菌能产生杀死细菌的物质，青霉素（Penicillin）。第二次世界大战青霉素疗伤杀菌的需求量急剧增加。英国与美国科学家1941年共同开发了通风搅拌深层培养法，实现了青霉素大规模工业生产。通风搅拌技术成为第二个转折期。 特点：由分解代谢转为合成代谢，机械搅拌液体深层发

3、酵罐诞生，微生物学、生物化学、生化工程三大学科形成完整体系。,4 代谢控制发酵技术（代谢控制发酵阶段1957-1960） 发酵工业第三个转折期。 1956年日本首先成功利用自然界存在的野生生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵生产，此后，精氨酸、苏氨酸等一系列氨基酸都采用发酵法生产。 利用诱变育种和代谢控制技术发酵生产氨基酸、核苷酸等多种产品。 特点：发酵罐达500-2000m3由初级代谢产物到次级代谢产物，发展了气升式发酵罐（降能提高供氧），多种膜分离介质问世,5发酵原料的转变（全面发展阶段1960-1979） 由传统的粮食、农副产品等糖质原料，到石油化工副产物石蜡、醋酸、甲醇以及甲烷等碳氢化合物为

4、发酵原料，开始了石油发酵时期。 用醋酸生产谷氨酸，用甲烷、乙醇以及石蜡生产单细胞蛋白、柠檬酸等已达到工业化水平。 另外，国内外对纤维废料作为发酵工业原料的研究取得一定进展，如用纤维废料生产酒精和乙烯等能源物质已取得成功。 特点：采用新原料、新设备（发展了循环式发射式发酵罐）、新技术（生物合成与化学合成相结合）生产维生素和新型抗生素，发酵向大型化、多样化、连续化、自动化的方向发展。,6 遗传工程的应用（基因工程阶段1979-） 利用DNA重组技术构建生物细胞发酵生产通常由高等生物细胞才能生产的有关化合物. 由于基因工程在发酵技术中的应用，一些极为珍贵的精细化工产品如生理活性肽物质(如人生长激素、

5、胰岛素、干扰素等)，都可通过发酵法来生产。 特点：按照人们的意志改造物质，发酵生产人们希望的产品，生物反应器由传统的钢铁设备转为昆虫躯体，动物的乳腺、植物的根茎叶果实等。基因工程技术使发酵工程发生了革命性的变化。,二、发酵工程的内容及生产流程 发酵工程又称为微生物工程，是指传统的发酵技术与DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等技术结合并发展起来的现代发酵技术。 包括培育优良菌种、发酵生产某些代谢产物、生产微生物菌体、改造某些天然物质等。 在工业生产中，发酵工程可以认为是直接利用微生物的机能将物料加工以提供产品或为社会服务（环境保护）的过程，又称微生物工程。,发酵过程由6个部分组成的： 确定的种

6、子培养基和发酵培养基的组成； 培养基、发酵罐和辅助设备的灭菌； 大规模的有活性、纯种的种子培养物的生产； 发酵罐中微生物的生长条件下产物的大规模生产； 产物的提取、纯化； 发酵废液的处理。,典型的发酵过程,图11 典型的发酵过程示意图,三、我国发酵工业的现状和未来 我国自20世纪50年代以来，使酱油、醋、酒等传统发酵工业得到了改革和更新。建立起了抗生素、氨基酸、柠檬酸、维生素、微生物多糖等一系列发酵工程，并形成了完整的工业体系。 发酵工程在工业上的应用具有投资少、见效快、污染小的优点，它是未来社会经济的支柱-生物工程的重要组成部分。,发酵工程的进展方向： 1 食品微生物的改良 采用常规的诱变、

7、杂交方法与细胞融合、基因工程技术结合，进行菌种改良和构建“基因工程菌”，改良食品微生物的生产性能，提高食品的营养价值及加工性能。 如将乙酰乳酸脱羧酶基因克隆到啤酒酵母中进行表达，可降低啤酒双乙酰含量而改善啤酒风味；选育出分解一葡萄糖和糊精的啤酒酵母，能够明显提高麦芽汁的分解率并改善啤酒质量；,双乙酰的形成,酵母代谢形成双乙酰,2 生产食品添加剂和功能性成分 甜味剂中的木糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、甜味多肽等； 氨基酸中各种必需氨基酸； 增稠剂中的黄原胶、普鲁兰、茁霉多糖、热凝性多糖等； 风味剂中的多种核苷酸、琥珀酸钠、香茅醇、双乙酰；芳香剂中的脂肪酸酯、异丁醇等； 色素中的类胡萝卜素、红曲色素

8、、虾青素、番茄红素等； 生物活性添加剂中的各种保健活菌、活性多肽等； 防腐剂中的乳链菌肽、杀菌肽、瓜蟾抗菌肽、防御素等。,3 可直接应用于食品生产过程的物质转化： 利用发酵技术、酶技术对农副产品进行加工，直接生产各种发酵食品如饮料、酒、酱、酱油、醋、乳酸、酸奶、啤酒等。利用基因工程和酶工程，构建“生物工程菌”来生产酶制剂。,4 工业化生产功能食品 利用发酵工程生产功能食品或功能性成分，如低聚糖、糖醇、单细胞蛋白、EPA、DHA、一亚麻酸、有益菌等。,DHA,5 食品包装和食品检测方面的应用 主要是制造一种有利于食品保质的环境。 如溶菌酶能消除有害微生物的繁殖，而让某些有益菌得以繁殖，被广泛应用

9、于酒、乳制品、水产品、香肠、等食品中以延长保鲜期。,6 可降解材料的开发 烷基糖苷 APG 它是用葡萄糖和脂肪酸为初始原料合成，是一种性能较全面的新型非离子表面活性剂，兼具普通非离子和阴离子表面活性剂的特性,具有高表面活性、良好的生态安全性和相溶性，是国际公认的首选“绿色”功能性表面活性剂。无毒无害，对人体皮肤无刺激作用，能在自然条件下完全降解，用其生产高档洗衣粉，生产高档香波和护肤膏。还能作为农用薄膜的防雾防滴剂，对土壤和环境无任何有害残留物，也可作为食品乳化剂、防腐剂、起泡剂等 。, 氨基酸聚合物 是采用氨基酸，碳水化合物，糖蜜等材料利用纳豆菌的天然发酵方式进行生物聚合，再经过提纯而来的高

10、活性大分子物质-Polyglutamic acid (-聚谷氨酸-PGA) (国际专利）此聚合物具有强力清洁、强力活化、保湿及高安全性等多重特性； 。 氨基酸表面活性剂不仅安全，对皮肤、头发刺激性小，起泡性好，去污力强，而且有一定抗菌抗氧化性，可增强人体对矿物质和维生素的吸收，用于医药、功能食品和饮料。,其主要的独特功能如下：1.提高肥料活性功能，增加肥力30%。2.对磷肥、钙肥等较难吸收营养元素，具有活化、吸附、传输的效果。3.具有清洁包埋及强保湿性、提供肥分更好的供应吸收环境。4.能直接触动表面细胞（叶片或根毛）代谢酶的活性，大幅度增强细胞的吸收活力。5.可增强因土壤传播的植物病原的抗性。

11、6.对酸、碱具有绝佳缓冲能力，可缓解、改善土壤板结化、盐积化。,1.2微生物及其发酵过程,一、发酵工业常用微生物 工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌，藻类、病毒等也正在逐步地变为工业生产用的微生物，其它微生物有担子菌、藻类。 在食品行业被广泛使用的微生物，包括细菌，酵母和霉菌。,二、微生物营养与培养基 依据培养基的用途，可将培养基分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 （1）孢子培养基是供菌体繁殖微生物孢子用的。主要是霉菌作为微生物发酵的生产菌种。 （2）种子培养基是供孢子发芽和菌体生长繁殖用的。也是微生物发酵过程中扩大培养的一个步骤。,（3）发酵培养基 是供菌体大规模生

12、长繁殖和合成大量代谢产物用的营养物质和原料。其组成要求适当地丰富和完全，能保证微生物迅速形成足够量而又健壮的菌丝体。 培养基的营养成分：碳源、氮源、无机盐类（包括微量元素）、生长因子、水、产物形成的诱导物、前体和促进剂等几类。,三、微生物发酵的一般流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,发酵工业的生产流程,四、微生物发酵的方式 根据微生物的种类不同分为： （1）好氧性发酵在发酵过程中需要不断地通人一定量的无菌空气，如利用黑曲霉进行柠檬酸发酵。 （2）厌氧性发酵发酵时不需要供给空气，如乳酸杆菌引起的乳酸发酵、

13、梭状芽抱杆菌引起的丙酮、丁醇发酵等。 （3）兼性发酵酵母菌是兼性厌氧微生物，它在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧性发酵，大量繁殖菌体细胞。 按照设备来分：敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵、深层发酵,1.3发酵操作方式及过程控制,按照使用的培养基的物理性状分为： 固体发酵是一种使微生物在固体表面或内部生长的发酵方法，简便易行，投资少，适合小型生产。缺点是发酵时间长，生产强度大，容易污染，传统设备不适宜进行纯种发酵。传统食品如酒类、饮料、酱油、醋等均采用固体发酵。 液体发酵是一种使微生物在液体培养基中生长的发酵方法，目前我国和世界大多数国家的发酵工业多采用深层液体发酵法。,一

14、、深层发酵的操作方式 深层液体发酵法是指在液体培养基内部（不仅仅在表面）进行的微生物培养过程。它具有很多优点： 液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境。 在液体中，菌体及营养物、产物（包括热量）易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行，便于控制。 液体输送方便，易于机械化操作。 占地少，效率高，易自动化控制，产品质量稳定。 产品易于提取、精制等,根据微生物发酵的运行方式分为分批发酵，连续发酵和补料分批发酵。 1分批发酵,是将营养物和菌种一次加人进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外部没有物料交换。过程为一个发酵周期。,2连续发酵,又称连续培养，是指把新鲜的培养基连续地供给均

15、匀混合的发酵系统，同时又以相同的速度把含有细胞和产物的发酵液从发酵系统中抽出的发酵过程，使培养物在近似恒定状态下生长的微生物发酵模式。 微生物在稳定状态下生长，稳定状态可以有效地延长分批培养中的对数期,连续发酵有什么优点和缺点？ 优点：使产率和产品质量也相应保持稳定；更有效地实现机械化和自动化；提高设备利用率，节省劳动力和工时；由于灭菌次数减少，使测量仪器探头的寿命得以延长；容易对过程进行优化，有效地提高发酵产率。 缺点： 由于是开放系统，加上发酵周期长，容易造成杂菌污染；微生物容易发生变异；技术要求较高；粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长和在发酵液内结团，给连续发酵操作带来困难。,分批培养与

16、连续培养比较,3. 补料分批发酵,补料分批发酵又称半连续发酵，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术，是指在微生物分批发酵中，以某种方式向培养系统添加新鲜的培养基（如对于菌体生长限制性的底物）或添加剂（如产物的生成前体物）的培养技术。通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内，既保证微生物的生长需要，又不造成不利影响，从而达到提高产率的目的。,二、深层发酵的过程控制 对发酵过程影响较大的有温度、pH值、溶解氧浓度等。,1温度 酶动力学 温度升高，反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，菌体易于老化，发

17、酵周期缩短，影响产物的最终产量。 改变发酵液的物理性质 温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率；菌对某些基质的分解吸收等。从而间接的影响菌的生物合成。 影响生物合成方向 生产四环素的金色链霉菌同时能产生金霉素,当温度低于30时,产金霉素能力较强,随着温度的提高,合成四环素的能力也提高,到达35时,则只产四环素而金霉素的合成几乎停止 。 发酵温度可通过温度计或自动记录仪表进行检测。 通过向发酵罐的夹套或蛇形管中通入冷水、热水或蒸汽进行温度调节。,2pH值 p值对微生物的影响有： 影响酶的活性； 影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢产物的排泄；

18、 影响培养基中某些组分和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用； p值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。,pH值的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。培养基中的营养物质的代谢，是引起pH值变化的重要原因，发酵液的pH值变化乃是菌体产酸和产碱的代谢反应的综合结果。 常用以生理酸性物质(NH4)2SO4和生理碱性物质氨水来控制。此外，用补料的方式来调节pH值也比较有效。,3溶解氧浓度 对于好氧发酵，溶解氧的浓度是最重要参数之一 采用复膜氧电极来检测发酵液中的溶解氧浓度。 可以通过调节搅拌转速或通气速率来控制。控制补料速度，还可采用调节温度（降低

19、培养温度可提高溶氧浓度）、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂等工艺措施，来改善溶氧水平。,4 CO2 浓度 CO2和HCO3-都能影响细胞膜的结构，影响细胞膜运输效率，细胞生长收到抑制，形态也发生改变， CO2还会造成发酵液pH的改变，从而影响菌体的生长代谢。 采用通风搅拌的方法来控制CO2的浓度，通气不仅能增加溶氧，而起可以使发酵过程中产生的CO2不断排出。对于CO2溶于发酵液中产生的碳酸造成pH值下降的问题，可以用碱中和。,5泡沫控制 泡沫，是空气溶于发酵液和产生CO2的结果，过多时就会引起发酵液溢出造成浪费，泡沫上升渗漏，造成杂菌污染，降低发酵罐的装填系数，影响氧传递等。 消除泡沫的方

20、法有物理法、机械法、化学法等。 物理法利用改变温度等方法使泡沫粘度或弹性降低使其破裂。 机械消泡法主要是利用耙式消泡器、蝶片式消泡器等机械力打破泡沫或改变压力，促使气泡破裂。 化学消泡法是使用消泡剂（一般为表面活性剂）如天然油脂（花生油、玉米油等）、聚醚类、醇类类等化学物质。,1.4发酵设备,一、发酵罐的类型 1按微生物生长代谢供氧需要分类 分成好气和厌气两大类。 抗生素、酶制剂、酵母、氨基酸、维生素等产品是好气发酵罐中进行的； 丙酮、丁醇、酒精、啤酒、乳酸采用厌气发酵罐。,2按照发酵设备特点分类 分为机械搅拌通风发酵罐和非机械搅拌通风发酵罐。 3按容积分类 一般认为，500L以下的实验室发酵

21、罐，500L5000L是中试发酵罐，5000L以上是生产规模的发酵罐。 4按微生物生长环境分类 发酵罐内存在两种系统，即悬浮生长系统和支持生长系统。一般说来，大多数发酵罐都有这两种系统。,二、好氧发酵设备 常用的好氧发酵罐有机械搅拌式、气升式、自吸式和鼓泡式等。 1机械搅拌式发酵罐 是利用机械搅拌器的作用，促进氧的溶解，以保证供给微生物溶解氧。 典型的是通用式发酵罐和自吸式发酵罐。,通用式发酵罐 既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置的发酵罐。, 自吸式发酵罐 是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。,用泵将发酵液压入文氏管中，由于文氏管的收缩段中液体的流速增加，形成真空将空气吸

22、入，并使气泡分散与液体混合，微生物从而获得生长和代谢所需要的氧。,用离心浆料泵将料液从罐中引出，通过外循环管返入罐内。在循环管顶端再接上液体喷嘴，使之能吸入外界空气的,称喷射自吸发酵罐。,2气升式发酵罐 工作原理是在罐内或罐外设上升管，或在罐内设导流筒，上升管两端分别与罐底及罐上部连接，形成循环系统。在上升管的底部设有空气喷嘴，喷嘴将无菌压缩空气高速喷入上升管或导流筒中，并使空气分割细碎，与上升管中的发酵液均匀混合。由于上升管中的发酵液含有大量气泡而使密度下降，加上压缩空气的喷流作用，因此使上升管中的液体上升，罐内的发酵液由于含气率小而下降并进入上升管底部，形成反复循环，并不断提供微生物所需的

23、溶氧量。,三、厌氧发酵设备 也称静止培养，其不需供氧，设备和工艺简单。 特色是排除发酵罐中的氧。罐内的发酵液应尽量装满，有时还需充入非氧气体。发酵罐的排气口要安装水封装置，培养基应预先还原。此外，厌氧发酵需使用大剂量接种（一般接种量为总操作体积的10%20%），使菌体迅速生长，减少其对外部氧渗入的敏感性。 酒精、丙酮、丁醇、乳酸和啤酒等都是采用液体厌氧发酵工艺生产的。具有代表性的厌氧发酵设备如酒精发酵罐和用于啤酒生产的锥底立式发酵罐。,1酒精发酵罐,2啤酒发酵设备,1.5发酵产物分离过程,一、微生物发酵产物的分类 根据菌种的来源分为：霉菌发酵产品（如火腿、奶酪），酵母发酵产品（如酒精、面包）和

24、细菌发酵产品（如酸乳）。 根据代谢产物的不同分：为初级代谢产物和次级代谢产物。 根据微生物发酵产物的存在位置分为：胞内或胞外产物。 食品行业，根据产品的应用来分类： 微生物菌体发酵产物，例如面包酵母、乳酸菌等。 微生物代谢物，例如酶、有机酸、氨基酸、多糖、色素等。 微生物只在发酵食品的加工过程中起了关键作用，例如火腿发酵、奶酪发酵、酱油发酵、酿造酒发酵等。,新鲜乳酪,白霉乳酪,蓝纹奶酪,半硬奶酪,硬质奶酪,二、发酵液预处理和固液分离 微生物发酵产物的提取纯化的原则：低温、快速、条件温和。 发酵产物分离提取过程中采用单元操作方法,表1-2用于微生物发酵液液固分离的单元操作,萃取液澄清,细胞 分离

25、,细胞 破碎,浓缩,微生物发酵,高度纯化技术,浓缩形成产品,胞外产物,植物或动物源 的原料,图 微生物发酵产物提取精制通用方法流程,-沉降 -离心 -单向过滤 -错流过滤,-高压均质 -湿磨 -细胞溶解,-离心 -萃取 -单向过滤 -错流过滤,-沉淀 -分批吸附 -超滤,-层析精制 （离子交换 亲和层析 疏水层析 凝胶层析 -电泳,-无菌过滤 -分子过滤 -超滤 -冷冻干燥 -喷雾干燥 -沉淀,细胞的破碎生物、化学和物理的方法。机械方法通常用于大规模的应用场合。工业上占主导地位的两种方法分别是：高压均质和湿磨。,大规模生产,三、提取和精制 目的是缩小处理液体积，提高发酵产物的浓度。通常采用的提

26、取方法有四种：沉淀法、超滤法、间歇吸附法和分配法。 1沉淀法 根据发酵产物在等电点时，或在一定浓度的有机溶剂、中性盐类或有机沉淀剂中溶解度降低而析出沉淀、或发酵产物一些酸、碱、盐类等形成不溶性盐类或复合物而析出沉淀的原理，从而达到分离提取的目的。,2盐析法(中性盐沉淀法) 由于中性盐(如硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等)的亲水性大于酶蛋白的亲水性，当加入大量中性盐时，它们能夺去酶蛋白表面的电荷，又使酶蛋白表面的电荷被中和，而使沉淀析出。,3等电点沉淀法 有些发酵产物例如酶、氨基酸和某些抗菌素具有两性电离的性质，因而在等电点时这些发酵产物的溶解度最小。,4.有机溶剂沉淀法,可能的机理,其机理的还不明，有的认为是有机溶剂的亲水性比蛋白质的亲水性大，由于对水的