发酵工业菌种.ppt

1、第二章,发酵工业菌种,本章内容,1 菌种筛选,2 菌种改良,一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种分离筛选,1 菌种筛选,一、常用的工业微生物 p13,1、细菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌,乳酸杆菌,醋化醋杆菌,枯草杆菌,1、细菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌,丙酮丁醇梭菌,谷氨酸棒状杆菌,2、酵母菌 酿酒酵母 假丝酵母属 产朊假丝酵母 解脂假丝酵母 热带假丝酵母 毕赤酵母属、汉逊酵母属,一、常用的工业微生物,酿酒酵母,热带假丝酵母,热带假丝酵母,产朊假丝酵母,3、霉菌 曲霉属 米曲霉 黑曲霉 青霉属 青霉菌：点青霉、产黄青霉 桔青霉,一、常用的工业微生物

2、,青霉属,产黄青霉,曲霉属,米曲霉,黑曲霉,3、霉菌 根霉属: 德氏根霉 米根霉、小麦曲根霉 红曲霉属 紫红曲霉,根霉属,米根霉,4、放线菌 链霉菌属 小单孢菌属 地中海诺卡氏菌,一、常用的工业微生物,5、未培养微生物p14,定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物。 其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99。,一、常用的工业微生物,二、发酵工业菌种分离筛选P15,菌株分离：将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。,（一）、 菌种选择的要求p15,培养基原料来源广、产物易回收

3、 发酵周期较短； 条件易控制； 抗病毒（噬菌体）、杂菌能力强； 菌种不易变异退化； 对放大设备的适应性强； 菌种不是病原菌,（二）、菌种分离的一般过程 P15,标本采集, 预处理, 富集培养, 菌种分离（初筛、复筛）, 发酵性能鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大？,如何在后续的操作中使这种可能性实现？,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：, 菌种保藏,1、样品的采集p15,样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。 采样时应注意的问题: A、土壤的有机质含量和通风状况 B、土壤的酸碱度和植被状况 C 、地理条件 D 、季节条件,A、土壤的有机质含量和通风状况 P16,耕地、菜园、

4、近郊土壤：土质通气保水性能好，微生物生长旺盛，数量多，尤其细菌和放线菌较多,山坡上的森林土壤：有机质丰富，微生物生阴暗潮湿，适合霉菌和酵母菌生长,沙土、贫瘠的土地：细菌数量少,果园：树根土壤中酵母菌含量较高（偏酸）,豆科植物根系土壤：根瘤菌较多,B、土壤的酸碱度和植被状况,腐殖土：霉菌较多,油田土壤：分解石油的微生物较多,自然环境中的天然菌群，可因人类的生产或生活而改变。 如在土壤中加去莠津（2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪 ），会导致放线菌群的增加；在杀真菌剂存在下，诺卡氏菌属的菌更容易分离到。,C、地理条件,南方温度高、温暖季节长、雨水多、相对湿度高、植被覆盖面广、土壤有

5、机质丰富：许多工业微生物菌种，如抗生素产生菌，尤其是霉菌、酵母菌，大都从南方获取,北方：秋季采土样最为理想,D 、季节条件,上节知识回顾,一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种分离筛选 1、样品的采集 A、土壤的有机质含量和通风状况 B、土壤的酸碱度和植被状况 C 、地理条件 D 、季节条件,采土样的方法,南方：用取样铲，将表层5cm（阳光直射，蒸发量大水分少，而且受紫外线照射）左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。 北方：土壤干燥，可在1030cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。 一般样品取回后应马上分离，以免微

6、生物死亡。,目的：提高菌种分离的效率。 物理方法：加热(55,6min；100,1h；40 2-6h)、膜过滤法、离心法、空气搅拌法 化学方法：含1%几丁质培养基、用CaCO3提高pH值进行培养（链霉菌属） 诱饵法：用涂石蜡的棒置于碳源培养基中（诺卡氏菌）、花粉（游动放线菌）、蛇皮（小瓶菌属）、人头发（角质菌属）,2、样品的预处理 p16,富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。,3、

7、富集培养 p17,富集的基本方法： 1、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物； 2、控制培养条件：如pH、温度、通气量等； 3、抑制不需要的种类。,富集培养方法： 1、分批式富集培养（P17）：指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复几次后，再取此富集培养物接种至固体培养基上，以获得单菌落。转种是关键。 2、连续培养（P17）：通过改变限制性基质浓度，来控制两类不同菌株的比生长速率。 3、半连续培养（P18）：即分批补料培养,4、菌种分离P18,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基；,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素。,从形态的角度,菌落的外观形态

8、，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,（1）、常规分离法：,平板划线法 稀释分离法 涂布法,A 分区划线法 B 连续划线法,将样品分散到最低浓度,倒平板，培养，挑取单菌落,后面3个稀释度各取0.1 ml涂布,透明圈法 变色圈法 抑菌圈法 生长圈法,（2）、生化反应分离法：,在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。,圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。,透明圈法,例1：分离某

9、种产生有机酸的菌株时，在培养基中添加碳酸钙。,例2：分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为唯一碳 源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落 后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水 解圈来区别产酶菌株。,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。,变色圈法,例1：分离果胶酶产生菌，用含0.2%果胶为唯一碳源，菌落长成后加入0.2%的刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现降红色的变色圈。 例2：分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基内，产生蛋白酶的菌落由于水

10、解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据变色圈便可选出平板上产蛋白酶菌株。,若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。,抑菌圈法：,常用于抗生素产生菌的分离。工具菌的选择是关键，工具菌采用抗生素的敏感菌。 传统上常用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为工具菌检验抗生素的抗性，现采用联合工具菌如枯草芽孢杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌，可分离出抗菌活性低，对其它试验菌活性高的新抗生素，如黄色霉素族的抗生素，而这些抗生素在单独使用枯草芽孢杆菌作工具菌时无法检出。,抑菌圈自动测量分析仪,如，嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与

11、不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品进行保温培养，周围出现生长圈的菌落即为 。,常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。,生长圈法：,2 发酵工业菌种改良,一、诱变育种 二、航天育种,自然选育,一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。,单细胞(孢子)悬液的制备,平板分离,挑选单菌落 (注意形态的观察),发酵试验,自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。但其突变率很低，因而要采用新方法进行菌株的改良。,改良的具体目标p23,提高目标产物的

12、产量 提高目标产物的纯度，减少副产物 改良菌种性状，改善发酵过程 改变生物合成途径，以获得高产的新产品,改良的方法,常规育种(诱变育种) 细胞工程育种 基于代谢调节的育种技术 基因工程育种 蛋白质工程育种 代谢工程育种,一、诱变育种,人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种。,诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质,从青霉素产量看诱变育种,效价：指有效成分的浓度。1g/ l称为1 单位,化学诱变剂都具毒性，其中90%以上是致癌物质或极毒药品，使用时要格外小心，不能宜接用口吸，避免与皮肤直接接触，不仅要注意自身安全，也要防上污染环境，造成公害

13、。,（一）、化学诱变剂使用过程的安全性,是一种强烈致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例用自来水大量冲洗或用1-2N的NaOH浸泡过夜，洗净。,NTG（N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍）,是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过EMS的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用10NaS2O3溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。,EMS（甲基磺酸乙酯）,(二）诱变育种应考虑的因素P25,1、选择合适的出发菌株,合适的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌

14、株。,定义：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株，也称亲株。,（1）选择出发菌株的要求, 对菌株产量，形态、生理等情况了解； 生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早； 对诱变剂敏感； 菌株要有一定的生产能力； 多出发菌株：一般采用34个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。,出发菌株及生理状态：真菌、酵母106个/ml，放线菌孢子106107个/ml,细菌108个/ml， 细菌选择对数生长期，真菌和放线菌使用幼年孢子，芽孢细菌也可以用芽孢进行诱变处理。 力求90%以上为单孢子，制菌悬液用生理盐水或缓冲溶液。,（2）出发菌株的选择,2、复合诱变剂的使

15、用 诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理。 复合处理有几类： 一类是两种或多种诱变剂的先后使用； 第二类是同一种诱变剂的重复使用； 第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。,剂量的大小常以致死率和诱变率来确定。 最适剂量是指能够提高正突变株变异频率幅度的诱变剂量。 处理剂量大，致死率高，诱变率也会提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会下降；但诱变剂量也不宜过低，否则很难获得所需的正突变株。 致死率90%99.9%（过去） 70%80%（现在）。,3、诱变剂剂量的选择,4、变异菌株的筛选 挑选菌株一般要从菌落形态变异类型着手，发现与产量相关的特征，并根据这些特征，进行筛选、鉴定。一般要经过初筛和复

16、筛两个阶段。 如:青霉素产生菌高产突变菌种的筛选,初筛：诱变后稀释涂布平板培养挑单个菌落到斜面培养将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶振荡培养测抗生素效价 超过对照效价10%以上的菌种，进行复筛。 复筛：过程与初筛基本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行13次。 由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。,（三）、诱变剂处理的方式,（1）直接处理：将菌悬液用诱变剂直接处理，然后分离。 （2）生长过程处理：适用于诱变作用强而致死率低的诱变剂，或只在分裂过程中对DNA起作用的诱变剂，如秋水仙素。这些诱变剂一般都直接加入到培养基中，混匀，

17、倒入平皿制成平板后培养，在生长过程中诱发菌体突变。 （3）振荡培养处理：即在摇瓶培养基中加入一定量的诱变剂。菌体随着振荡培养，不断地和诱变剂接触，它们之间的作用远比平板生长过程处理充分得多，所以诱变剂浓度不宜过高。,（四）、诱变筛选流程 (致死率、突变率、正变率、高产率、投产率),出发菌种,斜面,或摇瓶培养24h,细菌悬液,稀释涂平板,单孢子悬液,诱变处理,挑取单菌落200个,摇瓶初筛50株,挑出高产斜面,留种保 藏菌种,传种斜面,摇瓶复筛5株,挑出高产菌株,放大罐试验，中试考查,大型投产试验,诱变筛选过程 中的致死率、突变率、正变率、高产率、投产率,二、新诱变方法-航天育种,所谓航天育种是利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特