生物反应器.ppt

1、,汶川地震，“猪坚强”创造了生命奇迹，三年后，华大基因让“猪坚强”再次创造生命的奇迹此次克隆“猪坚强”是首次采用老龄猪体细胞克隆获得成功,第一节 动物、植物细胞培养器,一.动物细胞培养生物反应器 二.植物细胞反应器 三.酶生物反应器 四.藻类培养反应器,动物细胞培养的产物,微生物和动物细胞培养方法的比较,与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。,大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,

2、纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,动物细胞培养生物反应器,自70年代以来，用于动物细胞培养的生长反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模也越来越大。根据生物反应器的不同用途，有悬浮培养用、贴壁培养用、包埋培养用生物反应器等，其种类大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多层板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤维及其他膜式反应器、桨式搅拌反应器、棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜桨叶搅拌反应器、般帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、笼式通气搅拌反应器、双层笼式通气搅拌反应

3、器、空气提升式反应器等。,1、气升式细胞培养生物反应器,气升式反应器的基本原理如图所示。气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，但也有采用外循环式。,气升式生物反应器 气升式生物反应器(airlift bioreactor) 也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一, 其特点是结构简单, 操作方便。 气升式反应器中悬浮微载体培养Vero 细胞, 在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面, 终密度可达1. 13 106 个/ mL 。,2、动物细胞贴壁培养,滚瓶培养：将右图

4、所示的滚瓶装入培养液并在接种后，放到一个装置上，使滚瓶慢慢旋转，动物细胞就在滚瓶内壁生长繁殖，到一定时候将细胞收获。 中空纤维培养,中空纤维培养装置：该装置是由中空纤维管组成，每根中空纤维管内径为200m，壁厚为5070m，中空纤维管的管壁是半透性的多孔膜，氧与二氧化碳等小分子可以自由地透过膜双向扩散，而大分子的有机物则不能透过。 动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可很方便地获取营养物质和溶氧。由于该装置内可装置成千根的中空纤维管，故其生长表面积与体积之比可达40余倍，而起溶氧传质速率也比悬浮培养器高3倍。,中空纤维培养,中空纤维反应器示意图,细胞,培养基入口,培养基出口,中空纤维管生物反应器

5、,中空纤维管生物反应器如图所示，它的用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度最高可达109/ml数量级。如果控制系统不受污染，能长期运转。已用这种反应器培养过的细胞型和生产的分泌产物如表所示。,空气与CO2出口,空气与CO2入口,A 柱状中空纤维反应器,中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维管束制成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进出口。一般讲，细胞生长在壳体部分，新鲜培养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。壳体部分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲

6、出：若是非附壁性的应采用微滤材料将其截留在壳体内而让废培养液排出。,B 板框式中空纤维反应器,因柱状中空纤维反应器中营养供应和代谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布受到影响而不均匀。 人们开发出板框式中空纤维反应器。该反应器的中心是一束中空纤维浅床，置于两个不锈钢微孔滤板之间。,板框式中空纤维反应器,液营养 中空纤维板,3、流化床生物反应器,流化床生物反应器的基本原理类似于流态床化学反应器，不同的是，流态化的固体是带有细胞的微粒。培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。图为生产用CF-IM

7、MOTM流化床生物反应器的示意图，这种反应器的传质性能很好，并在循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物；反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不会损坏脆弱的细胞。由于流化床生物反应器满足了高密度细胞培养、使高产量细胞长时间停留在所应器中、优化细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求，流化床生物反应器既可用于贴壁依赖性细胞的培养，又可用于非贴壁依赖性细胞的培养。表11-11为流化床生物反应器达到的细胞密度。,气体交换,氧气,回流,收获,营养液,泵,反应塔,加热器,PH,传感器,T,DO,CO2,生产用CF-IMMOTM流化床生物反应器示意图,细胞灌注培养系统

8、实例,液位控制,细 胞 悬 液,细 胞,新鲜培养基,收液,过滤器,细胞培养系统,动物细胞的连续培养一般是采用灌注培养。灌注培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及除去有素毒的代谢物。灌注培养时用新鲜的培养液进行灌注，可以确保上述目的的实现。通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。灌注培养过程的特征如图11-13所示。,4 灌注培养,4.1中心灌流式反应器,4.2 灌流微载

9、体生物反应器,5 搅拌式生物反应器 搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性, 因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护, 因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对其造成损害, 传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以, 动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的, 包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。,供氧方式的改进 一般情况下, 搅拌式反应器还常伴有鼓泡, 为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感, 所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。 笼式供氧是搅拌式动物细

10、胞反应器供氧方式的一种, 即气泡用丝网隔开, 不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力, 以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器, 整体呈梨形, 搅拌置于反应器底部, 在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡, 丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。,搅拌桨的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大, 这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进, 并在反应器内加装了辅件, 实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨, 顶部的法兰盖

11、上安装了3 块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30, 垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力, 实验中用于昆虫细胞的培养, 最终的培养密度达到6 106 个/ mL , 成活率在98 %以上。,锥形动物细胞培养反应器：其外壳是一个圆锥形筒体，锥筒体内装有一个可旋转的塑料丝网气腔，在气腔的尖端部带有一螺旋桨搅拌器，靠螺旋桨的翻动，是培养液循环流动，也使微载体悬浮于培养液中。 特点;在塑料丝网气腔内，有一圈气体鼓泡管，同样也有四种气体通过配比调节来控制培养液的pH和溶氧浓度以满足动物细胞生长要求的条件。,6 锥形动物细胞培养反应器,二 植物细胞培养,动物、植物

12、细胞培养与微生物培养有较大区别，动物细胞没有细胞壁，需要“贴壁培养”，对培养基的营养要求和环境条件相当苛刻，对剪切力也很敏感；植物细胞可以像微生物一样在液体中悬浮培养，但对剪切力耐受性比微生物低；由于培养所需时间比微生物培养长，尤其是动物细胞的培养条件又非常适合杂菌生长，所以动物、植物细胞的培养系统需要有严格的防污染措施。,植物细胞培养,是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术。,植物细胞培养生物反应器,植物细胞反应器,对大多数植物细胞培养的研究而言，常用间歇式反应器来培养。通常使用的摇瓶、通

13、用式发酵罐、鼓泡式生物反应器、气生式生物反应器和旋转圆筒式的生物反应器都可用于植物细胞培养。,搅拌式反应器,气动式反应器,又称空气提升式反应器 特点：剪切力小，但搅拌不很均匀。,固定化反应器,种类： 包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等 附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。 Alfermann等(1983)用气升式系统，采用海藻钙固定细胞成功地用30 L和200 L的反应器生产地高辛。 Jose等(1983)进一步用中空纤维反应器培养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质,下图是工业规模进行烟草植物细胞的连续培养置，其反应器体积为20m

14、，搅拌叶直径为罐径 的。该装置进行连续培养时，其生成能力为5.82干细胞md,右图也是用于植物细胞培养的强制循环生物反应器,三 酶反应器,一、酶反应器的类型 二、酶反应器的选择和使用,酶反应器的类型 定义：以酶或固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置称为酶反应器(Enzyme reactor)。 作用：以尽可能低的成本，按一定的速度由规定的反应物制备特定的产物。 与化学反应器相比：在低温、低压下发挥作用，反应时的耗能和产能较少。 与发酵反应器相比：不表现自催化方式（即细胞的连续再生）。,酶反应器的类型,搅拌罐型反应器 超滤膜酶反应器 固定床型反应器 流化床型反应器 膜式反应器 鼓泡塔型反应器,（

15、一）搅拌罐型（Stirred Tank Reacter, STR）,有搅拌装置的、传统形式的反应器。由反应罐、搅拌器和保温装置组成。 1. 分类： 1）分批搅拌罐式反应器(Batch Stirred Tank Reactor, BSTR) 适用的酶：游离酶、固定化酶 2）连续流搅拌罐反应器(Continuous Flow Stirred Tank Reactor, CSTR) 适用的酶：固定化酶,（二）固定床型（也称填充床，Packed Bed Reactor, PBR ） 把颗粒状或片状等固定化酶填充于固定床内，底物按一定方向以恒定速度通过反应床。 在其横截面上液体流动速度完全相同，沿流动方

16、向底物及产物的浓度逐渐变化，但同一横切面上浓度一致。又称活塞流反应器(Plug Flow Reactor, PFR) 适用于：固定化酶。,（三）流化床型(Fludized Bed Reactor, FBR) 装有较小颗粒的垂直塔式反应器(形状可为柱形、锥形等)。底物以一定速度由下向上流过，使固定化酶颗粒在浮动状态下进行反应。流体的混合程度介于CSTR和PFR之间。 适用于：固定化酶。,（四）膜式反应器(Membrane Reactor),由膜状或板状固定化酶组装的反应器均成为膜反应器。根据酶的存在状态、相数、膜组件型式、膜材料类型、耦合方式、传质推动力等的不同，酶膜反应器有不同的分类方式。根据

17、膜组件的型式不同，可把酶膜反应器分为板框式、螺旋卷式、管式和中空纤维式酶膜反应器。以下以螺旋卷膜式反应器和中空纤维膜式反应器为例来说明。 膜式反应器是20世纪70年代以来发展起来的一种新型反应器，它是利用膜的分离功能，同时完成反应和分离过程的一种反应器。,1）平板状或螺旋状反应器 特点： 压力降小； 膜面积清晰； 放大容易 。 单位体积催化剂有效面积小。,螺旋卷膜式反应器 此反应器的螺旋结构是将含酶的膜片与支持材料交替地缠绕在中心棒上。所用的膜片一般是胶原蛋白；而支持材料则是一种称为凡克塞(vexar)的惰性聚合网状物。后者可以将相邻的两层含酶膜片分开来，以防止膜层相互重叠，堵塞流道。把上述螺

18、旋元件装进圆筒，筒两端加盖板，并安装进出口管，这样，就制成了螺旋卷膜式反应器。,含酶的膜是半透性膜，只允许小分子的底物和产物通过膜，而大分子酶则不能通过。该反应器有许多优点，例如，螺旋模型可将流体流动的单元分隔成许多独立空间，当底物溶液流经各个独立空间，并与酶接触时，均有相同的流体力学条件和停留时间，可改善接触效果，消除短路；另外，网状支持材料可以提高每一流动间隔的混合效果，加快物质传递。,2）空心酶管反应器 酶固定在细管的内壁上，底物溶液流经细管时，只有与管壁接触的部分进行酶反应。 管内径1mm，管内流动属于层流。多与自动分析仪等组装在一起，用于定量分析。,3）转盘型反应器 以包埋法为主，制

19、备成固定化酶凝胶薄板（成型为圆盘状或叶片状），然后装配在转轴上，并把整个装置浸在底物溶液中，更换催化剂方便。 有立式和卧式两种，卧式适用于需氧反应或产物有挥发性物，广泛应用于水处理装置。,4）中空纤维膜反应器 由外壳和数以千计的醋酸纤维制成的中空纤维(内径200m -500m，外径300m -900m)。组成。 内层紧密、光滑，具有一定分子量截流值，可截留大分子物质而允许不同的小分子物质通过。 外层为多孔的海绵状支持层，酶被固定在海绵状支持层中 。 反应器的形状为管式或列管式，中空纤维可承受较大压力，通过正常超滤程序将底物压入内壁与海绵状介质上的酶起反应。,反应器的形状为管式或列管式，中空纤维

20、可承受较大压力，通过正常超滤程序将底物压入内壁与海绵状介质上的酶起反应。,（五）鼓泡塔型反应器,利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混和这两种作用的一类反应器。是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。 适用于：游离酶、固定化酶 在使用固定化酶进行催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床反应器 。,（六）连续搅拌桶-超滤反应器(CSTRUF),图4-6 连续搅拌桶-超滤反应器,CSTRUF结构是CSTR与超滤装置联用的酶膜反应器。在CSTR出口处设置一个超滤装置，通过超滤装置，酶可以循环使用。其结构如图5-6。该超滤器中的半透性超滤膜只允

21、许小分子产物通过，不允许大分子酶和底物通过。因此，可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。,对这类反应器在技术上的可行性已得到了证实，例如进行纤维素的连续糖化、用-淀粉酶水解淀粉、用转化酶水解蔗糖和用青霉素酶把青霉素G转化成6-氨基青霉烷酸（6-APA）等生化过程。此外，还用于小分子产物（葡萄糖、麦芽糖）与大分子底物（淀粉、纤维素）的分离。,循环反应器（Recycle Reactor，RCR）,外循环反应器,内循环反应器,循环操作仍能为底物与酶提供足够的接触机会，以达到所需的转化率。这种反应器可用于难溶或者不溶性底物的转化反应。,三 微藻生物反应器,螺旋藻，小球藻，杜式藻 敞开式培养反应器 封闭式光培养反应器,光生物反應培養,十一五”国家科技支撑计划“海洋微藻高效培养工程化技术集成示范”课题取得阶段成果,近日，“十一五”国家科技支撑计划“海洋渔业与滩涂保护关键技术研究与示范”项目“海洋微藻高效培养工程化技术集成示范”课题顺利通过专家验收。课题组针对人类对微藻产品需求的不断增加，构建了二种自养微藻连续培养的生产工艺和示范基地，创建了异养稀释光自养串联高密度培养小球藻工艺并推广应用，构建了耦联光生物反应器+跑道池+开放大池的速生耐污型微藻规模化培养模