人表皮生长因子受体（EGFR）突变基因检测试剂（PCR法）注册技术审查指导原则（2018年）

1、附件1人表皮生长因子受体（EGFR）突变基因检测试剂（PCR法）注册技术审查指导原则本指导原则旨在指导注册申请人对人表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，以下简称为EGFR）突变基因检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是针对EGFR突变基因检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为

2、法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要详细阐明理由，并对其科学合理性进行验证，提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。一、范围本指导原则所述EGFR突变基因检测试剂主要是指基于核酸聚合酶链式反应（PCR法），以EGFR突变基因为检测目标，体外定性检测细胞学样本、病理组织学样本、外周血样本或其他体液样本提取的核酸组分中的目标基因序列。EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生

3、长因子受体（HER）家族成员之一。HER家族由EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3及HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的调节作用。EGFR是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变的亚裔人群阳性率要高于高加索人群。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显子上（1821），目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上

4、的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子20上的T790M替代突变为一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitor，TKI）的耐药突变。此外，还有许多类型的突变临床意义尚不明确。EGFR作为癌症治疗的分子靶标受到普遍关注，并已陆续开发出了吉非替尼（Gefitinib）、厄洛替尼（Erlotinib）和埃克替尼（Icotinib）等TKI。肿瘤组织样本仍是获取肿瘤基因相关信息的主要来源，但大部分晚期肺癌患者已失去手术机会或由于种种原因不能获取肿瘤组织样本。研究结果表明，实体肿瘤患者的外周血中存在来源于凋亡、坏死的肿瘤细胞的游离DNA。对晚期肺癌

5、患者，在不能获取肺癌组织样本时，可以选择外周血样本进行EGFR突变基因检测；如可以获得病理组织时，建议以病理组织提取检测结果为优先考虑。当肿瘤组织难以获取时，外周血样本可以是EGFR突变基因检测方式的重要补充手段之一。本指导原则相关技术要求主要基于荧光探针PCR方法的EGFR突变基因试剂进行评价，如基于荧光探针PCR原理的同类试剂不适用本指导原则部分相关技术要求，申请人应阐述不适用的理由并结合自身产品特性提出科学合理的评价方法，申请人可根据实际产品特性选择适合的方法或结合本指导原则补充需要的评价和验证。对于其他分子生物学检测技术，如适用，申请人可参考本指导原则部分相关技术要求进行性能评价。本指

6、导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。本指导原则不适用于EGFR基因拷贝数变化检测、核酸序列测定、免疫组化技术、荧光原位杂交法。EGFR病理组织学样本和外周血样本检测中存在较大差异，在参考品及质控品设置、分析性能评估、临床评价要求、产品技术要求、产品说明书等多个方面均存在不同要求，为便于申请人对指导原则进行理解，故将产品预期用途用于组织学样本检测和预期用途用于外周血样本检测试剂申报要求进行分开说明。需要说明的是，申请人申报产品如同时包括外周血样本和组织学样本，对于相同部分，申请人可合并提交注册申报资料。如原注册产品预期用途中仅为组织样本类型，需增加外周血样本类型，考虑到外周血样

7、本类型与组织样本类型中EGFR片段长度，样本中突变比例等差异，申请人除完成许可事项变更申报资料要求，还应提交扩增反应体系性能评价、外周血分析性能评价、外周血样本保存及处理、临床评价等研究资料。申报试剂作为肿瘤个体化伴随检测试剂，主要用于人非小细胞肺癌（NSCLC）个体化治疗。如申请人将EGFR申报试剂运用于其他癌症类型的研究，申请人可参照本指导原则适用的研究体系，但应强调的是，肿瘤药物个体化检测试剂与治疗药物具有关联性，申请人需结合EGFR突变基因检测与治疗药物预期用途所限定的癌症类型进行联合评价研究。二、注册申报资料要求（一）综述资料1.产品预期用途。描述产品的预期用途，与预期用途相关的临床

8、背景情况。EGFR突变基因与不同人群之间的关联，不同药物对不同EGFR突变类型的患者治疗效果描述。如适应症的发生率、易感人群等，相关的临床或实验室诊断方法等。2.产品描述。描述产品所采用的技术原理，主要原材料的来源及制备方法，主要生产工艺过程，质控品、校准品的制备方法情况。3.有关生物安全性方面说明。由于体外诊断试剂中的主要原材料可能是由各种动物、病原体、人源的组织和体液等生物材料经处理或者添加某些物质制备而成，人源性材料须对有关传染病（HIV、HBV、HCV等）病原体检测予以说明，并提供相关的证明文件。其他动物源及微生物来源的材料，应当提供相应的说明文件，证明其在产品运输、使用过程中对使用者

9、和环境是安全的，并对上述原材料所采用的灭活等试验方法予以说明。4.有关产品主要研究结果的总结和评价。5.其他。包括同类产品在国内外批准上市的情况。相关产品所采用的技术方法及临床应用情况，申请注册产品与国内外同类产品的异同等。对于新研制的体外诊断试剂产品，需要提供被测物与预期适用的临床适应症之间关系的文献资料。（二）主要原材料的研究资料此类产品的主要原材料应包括EGFR突变基因检测试剂的所有主要组成成分，如引物、探针、酶、反应缓冲液、提取成分（如包含）等。如为申请人自行研制的主要原材料，申请人应对EGFR目的基因序列确定、引物和探针选择、酶的选择和验证等实验过程予以详述；并提供对各主要原材料的性

10、能研究资料，如：外观、纯度、蛋白浓度、功能性研究等。制备完成的原料成品应进行质量检验以确认其符合标准要求，整个生产工艺应稳定可控。如为申请人外购主要原材料，应详述每一原材料外购方来源，提交外购方出具的原材料性能指标及质量控制资料，并详述申请人对外购主要原材料的各指标质量要求以及确定该原材料作为本产品主要原材料的详细依据。1.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。2.PCR组分的主要原料（包括引物、探针、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：2.1脱氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCT

11、P和dTTP；应提交对其纯度、浓度、保存稳定性等的验证资料。2.2引物应优化每一单一突变基因专用引物的相对浓度，避免多个核酸靶序列同时扩增时出现相互影响和竞争。引物设计时，应对反应体系中所有引物进行筛选，避免引物二聚体形成。为保证每一靶序列检测准确性，EGFR检测试剂中每一突变基因引物的浓度必须进行优化，应根据靶序列突变性质、C+G含量等确定每一突变基因引物的长度和浓度，且单一引物最适浓度还应考虑所有引物浓度之间的相互影响。由一定数量的碱基构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方法纯化。需提供对引物的分子量、纯度、稳定性、功能性实验等的验

12、证资料。如为外购，还应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。应对引物结构进行对比，引物扩增区段不应有重复序列。2.3探针特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经PAGE或其他适宜方法纯化，在5-端（和/或3-端）进行标记，并经HPLC或其他适宜方法纯化，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物质检证明，如HPLC分析图谱，应对探针的分子量、纯度及标记的荧光基团进行核实，并进行功能性试验验证。2.4酶DNA聚合酶，应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具

13、热稳定性，如：94保温1小时后仍保持50%活性。尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG/UNG），具有水解尿嘧啶糖苷键的活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。逆转录酶，具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。应对酶活性进行合理验证。3.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。4.企业内部参考品企业内部参考品是保证产品性能稳定性以及检测值可溯源的重要构成之一。参考品研究应包括原料选择、制备过程、定值研究、评价指标、统计学分析等。申请人应对内部参考品的来源、基因序列设置等信息进行精确的实验验证，并提供参考品溯源过程的测量程序或参考方法的相关信息及详细的验证资料。

14、申请人应根据产品性能验证实际情况自行设定内部参考品，阳性参考品应着重考虑EGFR突变基因型别要求，阴性参考品则主要涉及对分析特异性（交叉反应）的验证情况。如该类产品有国家标准品，在不低于国家参考品要求前提下，申请人可以结合实际情况设置合理的内部参考品。具体要求如下：4.1组织样本参考品设置要求4.1.1阳性参考品阳性参考品中常见基因突变位点建议采用临床样本提取的DNA储备液或细胞系作为原料。其他突变位点可采用DNA储备液、细胞系或EGFR突变扩增产物模拟样本作为原料。如采用EGFR突变扩增产物作为阳性参考品，应尽可能模拟真实样本，需要对样本基质进行基质效应研究。试剂盒（分型或不分型）所能覆盖的

15、所有突变位点均应设置相应的阳性参考品，每个突变位点设置不同突变百分率梯度，其中至少应包括高浓度和低浓度阳性参考品。阳性参考品的突变形式及拷贝数需采用有效方法（如测序方法或数字化PCR等）进行确认，并明确接受标准。4.1.2阴性参考品可采用经确认无相应靶突变序列的DNA储存液。如野生型人基因组DNA，HER家族DNA等。4.1.3检测限参考品检测限参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有的突变类型。在进行最低检测限性能评估时，应设置多个梯度，主要从扩增反应终体系总核酸浓度和突变序列所占百分率两个方面进行评价，建议采用95%（n20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。4.1.4精密度参考品精

16、密度参考品原料要求参考阳性参考品，需至少包括弱阳性、中或强阳性水平的精密度验证，中/强阳性精密度参考品以常见突变类型或理论上较难测得的突变序列为主；同时设置阴性参考品精密度验证。4.2外周血样本参考品设置要求4.2.1阳性参考品阳性参考品中常见突变基因位点建议采用临床样本提取的DNA储备液或细胞系作为原料。考虑外周血中EGFR突变基因DNA含量较低，其他突变位点可以采用DNA储备液或细胞系或EGFR突变基因扩增产物模拟样本，样本基质应为人血浆或人工模拟样本，使用人血浆时，应提前确认人血浆中DNA背景浓度；使用人工模拟样本时，应尽可能模拟真实样本，并对模拟样本进行基质效应研究。试剂盒（分型或不分

17、型）所能覆盖的所有突变位点均应设置相应的阳性参考品，每个突变位点设置不同突变百分率梯度，其中需至少包括弱阳性参考品。阳性参考品的突变形式及拷贝数需采用有效方法（如测序方法或数字PCR等）进行确认，并明确接受标准。4.2.2阴性参考品可采用经确认无相应靶突变序列的DNA储存液。如野生型人基因组DNA，HER家族其他DNA等。4.2.3检测限参考品检测限参考品的原料要求参考阳性参考品，需包括所有的突变类型。在进行最低检测限性能评估时，应设置多个梯度，建议采用95%（n20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。4.2.4精密度参考品精密度参考品原料要求参考阳性参考品，需至少包括弱阳性、中或强阳性水

18、平的精密度验证，中/强阳性精密度参考品以常见突变类型或理论上较难测得的突变序列为主，同时设置阴性参考品精密度验证。5.试剂盒内对照品（质控品）试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸分离/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。对照品可采用质粒、假病毒或临床样本的核酸提取液等进行配置。申报资料应对试剂盒对照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。申请人应视申报产品具体情况设置合理的试剂盒对照品（质控品），试剂盒质控体系主要考虑以下几方面要求：5.1阳性对照品（质控品）申请人应对各阳性对照品（质控品）的Ct值提出明确的范围要求。如样本反应管内可以覆盖多种突变序列的检测（分型或不分型），相应的阳性对照管应选择较常见突变序列或理论上较难测得的突变序列作为阳性对照。5.2阴性对照阴性对照可以是含有野生型核酸序列的核酸溶液，也可以是空白对照，对交叉污染导致的假阳性结果进行质控。阴性对照品应参与样本核酸的平行提取。5.3内对照（内标）