生物化学酶的本质和组成

1、1,Biochemistrychapter2 enzyme,2,第二章 酶,第一节 酶的基本特性 第二节 酶的命名与分类 第三节 酶的催化机理 第四节 酶促反应动力学 第五节 酶活性的调控,3,Enzyme is biocatalyst,酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂(biocatalysts） 绝大多数的酶都是蛋白质。 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应（Enzymatic reaction）。 在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物（substrate）。,第一节 酶的基本特性,4,一、酶的本质和组成,1926年,James Summer由刀豆制出脲酶结

2、晶确立酶是蛋白质的观念，其具有蛋白质的一切性质。 19811982年，Thomas R.Cech实验发现有催化活性的天然RNARibozyme。 L19 RNA和核糖核酸酶P的RNA组分具有酶活性是两个最著名的例子。 抗体酶（abzymes）：1986年，Richard Lerrur和Peter Schaltz运用单克隆抗体技术制备了具有酶活性的抗体（catalytic antibody）。,酶的不同形式,单体酶(monomeric enzyme)：仅具有三级结构的酶. 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。 多酶体系(multienzyme

3、 system)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶(tandem enzyme)：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。,酶的分子组成,蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme),辅助因子 (cofactor),金属离子,小分子有机化合物,全酶 (holoenzyme),结合酶 (conjugated enzyme),单纯酶 (simple enzyme),7,*各部分在催化反应中的作用,酶蛋白决定反应的特异性 辅助因子决定反应的种类与性质,金属酶(metall

4、oenzyme) 金属离子与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。 金属激活酶(metal-activated enzyme) 金属离子为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。,8,金属离子的作用 稳定酶的构象； 参与催化反应，传递电子； 在酶与底物间起桥梁作用； 中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。,小分子有机化合物的作用 在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。,9,辅助因子分类 （按其与酶蛋白结合的紧密程度）,辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。,10,

5、二、酶的催化特点(characteristic),酶是生物催化剂，与无机催化剂相比，二者有共性； 但酶的化学本质是蛋白质，又在生物体内作用，因此酶的作用又有特性。,11,酶和一般催化剂的共性,1.用量少而催化效率高； 2.它能够改变化学反应的速度，但是不能改变化学反应平衡。 3.只能催化热力学允许的反应，在反应前后不发生改变。,12,酶催化作用特性,高效性 专一性,13,酶的催化作用可使反应速度提高106 -1012倍。 例如：过氧化氢分解 2H2O2 2H2O + O2 用Fe+ 催化，效率为610-4 mol/mol.S，而用过氧化氢酶催化，效率为6106 mol/mol.S。 用-淀粉酶

6、催化淀粉水解，1克结晶酶在65C条件下可催化2吨淀粉水解。,1高效性,14,酶的高效性与活化能和过渡态有关。,15,2专一性,酶的专一性 Specificity又称为特异性，是指酶在催化生化反应时对底物的选择性。根据专一性的不同又可分为： （1）立体化学专一性 立体异构 几何异构 （2）非立体化学专一性 键专一性 基团专一性 绝对专一性,16,立体化学专一性,酶的一个重要特性是能专一性地与手性底物结合并催化这类底物发生反应。 例如，淀粉酶只能选择性地水解D葡萄糖形成的1，4糖苷键。,光学专一性 Optical Specificity,17,几何专一性,有些酶只能选择性催化某种几何异构体底物的反

7、应，而对另一种构型则无催化作用。 如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸水合生成苹果酸，对马来酸则不起作用。,18,绝对专一性,有些酶对底物的要求非常严格，只作用于一个特定的底物。这种专一性称为绝对专一性（Absolute specificity)。,19,有些酶的作用对象不是一种底物，而是一类化合物或一类化学键。这种专一性称为相对专一性(Relative Specificity)。包括族(group)专一性和键(Bond)专一性 族(group)专一性。如-葡萄糖苷酶，催化由-葡萄糖所构成的糖苷水解，但对于糖苷的另一端没有严格要求。 键(Bond)专一性。如酯酶催化酯的水解，对于酯两端的基团没有严

8、格的要求。,键和基团专一性,20,酶作用专一性的机制,酶分子活性中心部位，一般都含有多个具有催化活性的手性中心，这些手性中心对底物分子构型取向起着诱导和定向的作用，使反应可以按单一方向进行。 “三点结合”的催化理论。认为酶与底物的结合处至少有三个点，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，不对称催化作用才能实现。,21,锁 钥 学 说,22,锁钥学说：,认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。,23,诱导契合学说,24,当底物与酶接近时，底物分子可以诱导酶活性中心的构象发生改变，使之成为能与底物分子密切结合的构象。,25

9、,诱导契合学说,该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。,26,三、酶的活力测定(定量),酶的活力:又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，酶的活力大小可用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示,即可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的生成量来表示. 一般采用高底物浓度S100Km(零级反应)测定初速度来定量酶浓度.,27,酶活力单位:最适条件下,单位时间内,酶催化底物的减少量或产物的生成量. 1个U（1U）:特定条件下,1分钟内生成1微摩尔产物的酶量(或转化1微摩尔底物的酶量). Kat:最适条件下,每秒钟可使1摩

10、尔底物转化的酶量. 即1Kat=6107IU,28,酶的转换数（turnover number） 单位时间，每个催化中心所转换的底物分子数。通常指每秒钟每个酶分子转换底物的微摩尔数，在数值上，KcatK3,酶的比活力 酶纯度的量度 每毫克酶蛋白所具有的酶活力，或单位质量、单位体积的酶活力 单位：U/g U/mL,29,酶活力测定方法,分光光度法（如mtt） 荧光法 同位素标记法 电化学方法 层析法 旋光法 显色方法（淀粉酶活性的测定）,30,目的：研究酶的理化性质。 包括结构与功能、生物学作用。 作为生化试剂及用作药物的酶要求纯度高,四、酶的分离和纯化,31,根据酶在体内作用部位,胞外酶-易分

11、离 胞内酶-须破碎cell,分离提纯的原则,选择酶含量丰富的材料 目前多采用微生物发酵的方法来获取大量的酶制剂 避免蛋白质变性：避免强酸、强碱，低温， 每一步骤，都要测定酶的总活力和比活力,32,a选材：动物、植物 ：含酶量高，易分离 细胞内酶,分离提纯的步骤,选材-破碎细胞-抽提-纯化-保存,33,b破碎细胞 动物 细菌 植物 研磨 超声波 纤维素酶匀浆 溶菌酶 捣碎机 化学溶剂 (甲苯) 提取液 c抽提 抽提条件的选取应根据酶的溶解度和稳定性等。 （用稀盐、稀酸、稀碱溶液抽提） 盐：一般用等渗盐溶液，如0.05mol/L 的PBS， 0.15mol/L的NaCl等； T：一般在0 4； p

12、H在其稳定范围内且远离其等电点。,34,操作要求： A. 尽量减少酶活性的损失 B. 低温 05 摄氏度 有机溶剂：-15 -20摄氏度 C. 抽提液加入EDTA（络合金属） D. 抽提液加入巯基乙醇（防止-SH氧化失活） E. 不能过度搅拌，以免产生大量泡沫，使酶变性 F. 测定酶的比活力,35,d. 纯化: 小分子能自然去除,大分子中核酸用鱼精蛋白或MnCl2沉淀去除,粘多糖用醋酸铅去除。 而主要工作则是去除杂蛋白。 纯化方法与蛋白质基本相同,此外常用选择性变性法如选择性热变性法(某些酶耐热).,36,纯化方法,选择性变性法 盐析法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀方法 吸附分离方法 几种方法配

13、合使用,37,提纯的目的:含量+纯度 工艺的选择应权衡含量与纯度,根据酶的应用目的和经济效益取得一个平衡点. 每一步都要测定酶的纯度(比活力)并计算纯化倍数和产率以决定该步骤的效益和取舍. 酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白 纯化倍数=每次比活力/第一次比活力 产率=(每次总活力/第一次总活力) 100%,38,e保存 将酶制品浓缩，结晶，以便保存（-20）注意：酶易失活，不可烘干。可用的方法：（1） 保存浓缩的酶液： （2） 浓缩液加入等体积甘油 -20长期保存,39,（一）习惯命名方法 （1）根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。 （2）根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、 转移

14、酶等。 （3）两个原则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶等。 （4）根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白 酶、胰蛋白酶等。,酶的命名(nominate),第二节 酶的命名和分类,40,（二）国际系统命名法 系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。 例如： 习惯名称:谷丙转氨酶 系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 催化的反应: 谷氨酸 + 丙酮酸 -酮戊二酸 + 丙氨酸,41,酶的编码,每个酶都有一个有四个数字组成的编码,42,（一）根据酶的化学组成可将酶分为： 单纯蛋白酶类：只含有蛋白质成分； 结合蛋白酶类（全酶）：含有蛋白成分（酶蛋白）和非蛋白成分（辅助因子）。,二、酶的分类,

15、43,（二）根据酶蛋白结构特点可将酶分为,单体酶：只含一条多肽链。以一个独立的三级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 寡聚酶：含多条多肽链亚基。以一个独立的四级结构为完整生物功能分子的最高结构形式的酶。 多酶复合体：由多种酶彼此镶嵌成一个功能完整的具有特定结构的复合体, 它们相互配合依次进行，催化连续的 一系列相关反应。,44,根据酶所催化的反应类型，按照国际系统分类方法，将酶分为六大类：,45,氧化-还原酶,催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如，乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1 氧化-还原酶,46,转移

16、酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。,2 转移酶,47,水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：,3 水解酶,48,4 裂合酶,裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。,49,异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。 常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。,5 异

17、构酶,50,合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 A + B + ATP + H-O-H = AB + ADP +Pi 例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸,6 合成酶,51,第三节 酶的催化机理,52,酶的分子结构是功能的物质基础，不仅与一级结构有关，而且与高级结构有关。,酶的结构与功能,活性部位：酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生反应的部位。酶活性中心包括两个部位。,53,酶的活性中心,酶的活性中心,54,主要包括： 亲核性基团：丝氨酸的羟基，半胱氨酸的巯基 和组氨酸的咪唑基。 酸

18、碱性基团：门冬氨酸和谷氨酸的羧基，赖氨酸的氨基，酪氨酸的酚羟基，组氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巯基等。,必需基团：在酶分子中和酶的催化活性直接有关的基团，活性中心内外都有。,必需基团：,55,底 物,活性中心以外的必需基团,结合基团,催化基团,活性中心,56,酶作用的专一性主要取决于酶活性中心的结构特异性。,酶的活性中心与酶作用的专一性,57,如胰蛋白酶催化碱性氨基酸(Lys和Arg)的羧基所形成的肽键水解，胰凝乳蛋白酶则催化芳香族氨基酸(Phe.Tyr.和Trp.)的羧基所形成的肽键水解。 X线衍射显示胰蛋白酶分子的活性中心线丝氨酸残基附近有一凹隙，其中有带阴电荷的天冬氨酸侧链(为结合基团)，故易与底物蛋白质中带阳电荷的碱性氨基酸侧链形成盐键而结合咸中间产物；而胰凝乳蛋白酶凹陷中则有非极性氨基酸侧链，可供芳香族侧链或其他大的非极性脂肪族侧链伸入。通过疏水作用而结合，故这两种蛋白酶有不同的底物专一性。,58,空间结构与催化活性,酶的活性不仅与一级结构有关，并且与其空间结构紧密相关，在酶活性的表现上，有时空间结构比一级结构更为重要。因为活性中心需借助于一定的空间结构才得以维持。 有时只要酶活性中心各基团的空间位置得以维持就能保持全酶的活性，而一级结构的轻微改变并不影响酶活性。,59,60,在酶促反应中，底物分子结合