ELISA检测原理及手足口病诊断中的作用ppt课件

1、ELISA基本原理及在手足口病实验室检测中的应用,内 容,ELISA的基本原理 ELISA的种类 ELISA的组成 ELISA结果判定 ELISA中的几个重要影响因素 ELISA的质量控制 ELISA在手足口病致病病毒检测中的应用。,1. ELISA的基本原理,ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。 ELISA的特点： 敏感度和特异度较高，重复性好。 试剂比较稳定，易于保存。 操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。 易于标准化和对检测对象进行定量。 可

2、以自动化。,抗原抗体反应,抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。,IgG和IgM抗体的三维结构,将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。 由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。 抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。,2.ELISA的种类-检测抗原,竞争法 ELISA将特异性抗体包被于固相载体表面，洗涤后分为两组，一组加入酶标抗原和被测

3、抗原的混合液，另一组只加入酶标抗原，经孵育洗涤后加底物显色，两组吸光度之差就是所测定未知抗原的量。,检测抗原,双抗体夹心法ELISA 将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。,检测抗体,间接法ELISA（Indirect ELISA）将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。,检测抗体,捕获法ELISA（Capture ELISA）专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤

4、后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。,检测抗体,双抗原夹心法ELISA检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体） 。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色。,3.ELISA试剂的组成,固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是聚苯乙烯材质的微孔板，多为8 12道96孔板条。 酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。 辣

5、根过氧化物酶（HorseRadish Peroxidase，简称HRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。 碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase ，简称AP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。 底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。 HRP邻苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD） 、四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS 2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后

6、由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。 AP对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。,洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯 ）。 标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。 RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸

7、附剂去除类风湿因子的干扰作用。,4.结果判断,S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。 S/N或P/N：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或 P/N2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1

8、倍视为Cut -off值而已 。,5.ELISA的几个影响因素,ELISA本身 方法学上，敏感度和特异性不能达到100%。 敏感度增加，则特异度降低，反之亦然。 不同的检测目的对敏感度和特异度的要求不同。如筛查需高敏感的检测试剂，而风疹CRS则需要高度特异的检测试剂。 不同生产商。,外部因素 孵育时间和温度。 标本的条件。 实验对照。 实验操作人员的教育背景和培训。 试剂保存条件和批号。 实验设备。 结果解释（免疫史、接触史等）。 结果的抄写和报告。,ELISA的影响因素-标本,采集时间。 有无溶血、黄疸。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测

9、定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 有无细菌污染。细菌生长所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 有无反复冻融。机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。,6.ELISA的质量控制,内部质量控制 标准化操作(SOP) 仪器设备的维护和校准 数据处理和报告 试剂内部质量控制 外部质量控制 人员培训 职能考核 实验室间复核 现场认证,确保实验室检测结果的准确和可信。,内部质控血清（In-house

10、Control, IHC）,什么是IHC？ 在每次ELISA试验时都要加入一个实验室自制的IHC。通过对IHC检测结果的监测，来确保不同时间、不同地点的相同检测结果的正确性和可重复性。 为什么不能用试剂本身的对照作为IHC？ 不能监测标本处理过程。 试剂对照本身的局限性，不能用于不同试剂。 有些试剂对照不是真血清。,质控图（举例）,3SD,-3SD,2SD,-2SD,6.ELISA在手足口病致病病毒检测中的应用。,商业化试剂检测EV71病毒IgM抗体。 贝尔 万泰 捕获法ELISA. 仍在评价中。 结果要谨慎判断。,手足口病的实验室检测,发病后从疱疹液、脑脊液、咽部、粪便中检测EV-71或CA

11、V-16等肠道病毒特异性核酸阳性。 在血液或脑脊液中查到抗EV-71或CAV-16等肠道病毒lgM抗体。急性期与恢复期血清中EV-71或CAV-16等肠道病毒IgG抗体阳转或有4倍增高。 急性期与恢复期血清中EV-71或CAV-16等肠道病毒中和抗体阳转或有4倍增高。 从疱疹液、脑脊液、咽部、粪便中分离到EV-71或CAV-16等肠道病毒者。,捕获法ELISA测抗体,IgM捕获法（贝尔试剂） 1.无IgG或类风湿因子的干扰 2.敏感性和特异性高,EV-71病毒IgM抗体检测-贝尔,试剂室温平衡30min以上。 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 编号：将标本对应微孔板按序编号，每

12、板应设阴性对照3孔，阳性对照1孔和空白对照1孔。 加稀释液：每孔加入标本稀释液100l，空白孔和阴性、阳性对照孔除外。 加样：分别在相应孔中加入阴性、阳性对照100l，待测标本10l，轻轻振荡混匀。 孵育：用封板膜封板后，37孵育50min。 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次扣干。 加酶标工作液：每孔加入100l，空白孔除外。 孵育：用封板膜封板后，37孵育50min。 洗板：操作同上。 显色：每孔加入显色剂A、B液各50l，轻轻振荡混匀，37避光显色15min。 测定：每孔加入终止液50l，轻轻振荡混匀，10min内测定结果。设定酶标仪波长于450nm，用空白孔调零后测定各孔A值。,试剂对照