聚合酶链式反应

1、1、基因克隆（感受态细胞制备、转化、质粒提取、酶切鉴定） 2、Western blot（蛋白质提取、SDS-PAGE、转膜、免疫检测） 3、RT-PCR（RNA 提取、逆转录、PCR）,分子生物学实验安排,实验考试,上课时间：9:00-,实验内容：,分子生物学技术,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）,Kary B. MullisUSA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method,The Nobel Prize in Chemistry 1993,PCR,PCR的产物

2、数目 以指数级方式增长,体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段,PCR 基本原理 PCR反应体系 PCR 结果分析 PCR 方法拓展 PCR 的应用,PCR 的基本原理,其原理类似于DNA的体内复制， 在试管中的DNA的体外合成。,Continuous replication,Discontinuous replication,岡崎片段 (okazaki fragment),replication fork,DNA的体内复制：,原料：,template DNA（genomic DNA ）， RNA primer，dNTPs,酶：,解旋酶，引物酶， DNA聚合酶， 连接酶,反应条件：,胞

3、液环境，37 ,反应过程：,起始（模板DNA解链、形成引发体）、 延长、终止（三阶段）,产物：,模板DNA （基因组DNA） 拷贝数增加一倍,PCR：,template DNA（genomic DNA ，cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPs,DNA polymerase,buffer，三种变化的温度（94，50-70，72 ），cycles（25-35）,denaturation、 annealing 、extension （三阶段，多循环）,目的DNA（特异性） 拷贝数增加 2n倍,Denaturation（变性）,te

4、mplate DNA (dsDNA) 95denaturation ssDNA,Annealing（退火）,Primer（引物）：两条寡核苷酸链；分别与待扩增的目标片段两端的序列互补。,Extension（延伸）,新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。,DNA聚合酶：催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物53方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。,变性-退火-延伸 一个PCR循环,尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，30次循环，酶的催化反应趋于饱和-平台效应 (Plateau) “平台效应”出现

5、的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。,理论上，n个循环后，产量为2n拷贝。 实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n， X为扩增效率，平均为75%,PCR反应体系与反应条件,50,template,血液 陈旧血痕 组织块或石蜡包埋组织 绒毛 毛发 羊水脱落细胞 尿 咽拭子,DNA,RNA,mRNA cDNA,primer,引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 2. 保证引物中G-C比例为50%15%，ATGC最好随机分布。 避免两条引物间或引物内部互补，特别是3端的互补。 4. length20bp Ta=62.3 C+0.41 C *(%GC) - 5

6、 C 保证每个引物的Tm值相匹配。 5. 检测目的DNA序列看是否有错配区域，计算机程序分析可以帮助避免使用设计不合理的引物对。,引物的3端: 必须严格互补 引物的5端: 可以不严格互补,可以加酶切位点， 加标记物,引入突变位点等,5-ggttacttccctcgatttgg gcggggattcccttccatttt tttcttcccttttctcccaagatccagcttcttggggg cactcacgggtgcccgttgcgttctgctccgtcg gcccc/ggagctgcatggccaactcccaccag gggccgctcctcccctaccccccacccccggg

7、 ctccctctttaagtctctagctcaaggtaccc gcct ctccaaagggctcgtccc-3(229bp),ggttacttccctcgatttgg,gaggtttcccgagcaggg-5,DNA polymerase,催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为 100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低 则合成产物量减少。,(dNTPs),dNTP是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称，是靶DNA 序列扩增的原料。 dNTP浓度根据靶序列的长度和组成而定， 一般使用浓度在50-200umol/L之间,buffer /Mg2+,常用的缓

8、冲液体系为10-50mmol/LTris-HCl（pH8.3-8.8,20） TaqDNA聚合酶需要游离Mg2+。,PCR反应条件,变性 95 5min 变性 95 1min 退火 55 1min 延伸 72 1min 延伸72 1min,35 cycles,Analysis of PCR products,Gel analysis (琼脂糖凝胶电泳/聚丙烯酰胺凝胶电泳 ) : PCR 产物电泳，EB（溴乙锭）染色， 紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。,Restriction-endonuclease digestion analysis： 酶切、电泳分离。 产物的鉴定，基因分型，研究变异性

9、。,Hybridization ： (Southern blot/dot blot ),electrophoresis/hybridization,Sequence analysis：是检测PCR产物特异性的 最可靠方法。,DNA测序,1.Sanger法（双脱氧末端终止法）,用4种2,3双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进行DNA合成反应，从而获得在不同部位终止反应的大小不同的DNA链，经高分辨率变性聚丙烯凝胶电泳分离，就可以对DNA序列进行分析,Sanger法测定DNA序列,2.DNA自动化测序,方法要点, 基于Sanger法的基本原理 用标记荧光染料的ddNT

10、P 经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 用荧光检测仪检测信号经计算机分析 得到DNA分子序列,DNA自动测序结果举例,PCR METHODS,STANDARD PCR HOT START PCR RT PCR IN SITU PCR PCR-ELISA REAL TIME QUANTITATIVE PCR,HOT START PCR In hot-start PCR ，at least one reaction component,which can include the polymerase, salt (KCl or MgCl2) or dNTP(s), is withheld from the

11、 reaction until the system reaches a particular temperature.,RT-PCR(Reverse transcription-PCR),1.RNA preparation 2.Reverse transcription 3. PCR 4. Result Analysis:Quantification or cDNA clone,Semi-Quantify RT-PCR,1.RNA preparetion 2.Reverse transcription 3. PCR: a.Target Gene Specified primer b. GAP

12、DH or -actin primer 4. Quantification,Target Gene,GAPDH or -actin,在相对定量检测中,为了比较不同样本mRNA 表达量水平,要求不同的样本之间起始细胞数目相同, RNA 提取效率相同,且目的基因的扩增效率相同,-不可能同时满足。,为了避免不同标本在RNA 的产量、质量及逆转录效率上可能存在的差别, 获得目标基因特异性表达的真正差异-选择一定的内参基因进行校正和标准化,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,根据实验，选择内参基因,REAL TIME QUANTITATIVE PCR,原理： 根据荧光染料形成 特异性荧光信号的 强度，计算出模板 D

13、NA或mRNA的含量 用途：定量分析mRNA或DNA 优点： 可进行自动化定量 分析、降低假阳性,实时PCR的基本过程,基因克隆 医学检测 (基因诊断),WHAT CAN PCR DO FOR US?,一、基因克隆:,PCR 应用,PCR Product,digest,mix,DNA ligase,plasmid,Gene cloning : PCR product + vector,PCR法,设计引物,分段PCR,基因改造,再次PCR,获得突变基因,(一). 基因突变的检测 1、基因缺失或插入,基因检测,2、点突变 位于酶切位点上的点突变：限制性酶切片段分析法 不在酶切位点上的点突变：单链构

14、象多态性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知点突变： PCR-SSCP,（单核苷酸多态性，SNP）,PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)限制性 片段长度多态性,1. 分析已知突变 。 2. 突变碱基涉及酶切位点的变化。 PCR- 酶切- 电泳,PCR-RFLP,Resistance to NcoI Digestion,Susceptible to NcoI Digestion,Homozygous Mutant,Homozygous Wild-type,Heterozygote,Direction of Elec

15、trophoresis,PCR-RFLP,单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)的原理及特点,单链DNA片段 复杂的空间折叠构象(主要是由 其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的) 一个碱基发生改变 影响 其空间构象, 在聚丙烯酰 胺凝胶中受排阻大小不同. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离构象上有差异的分子.,PCR-SSCP,SSCP,PCR,PCR,A,T,C,G,Wild,Amplify region of interested,Denature samples in Formamide or Heat,C,

16、G,Mutant,Denature samples in Formamide and Heat,C,G,A,T,C,G,DNA molecules conformation depends on their sequence,Run on a Non-denaturing gel and look for mobility differences,Wild,Mutant,SSCP,（二）基因异常表达的检测 即检测致病基因的mRNA，在表达水平提供基因功能是否正常的直接证据。可采用RT-PCR，灵敏度更高。 （三）外源基因的检测 适用于细菌、病毒、寄生虫等感染性疾病。,（四）法医鉴定（DNA指纹法） 个体识别和亲子鉴定,法医学个体认定,DNA指纹技术建于1985年 英国的遗传学家Jeffreys采用小卫星(20-70bp的寡核苷酸串联重复序列)作探针进行人基因组DNA的Southern bl