生物制药工艺学第1章、第2章.ppt

1、,主讲教师： 高向东教授 孔 毅副教授 何书英副教授 郑 珩副教授 中国药科大学 生命科学与技术学院 2007.10,生 物 制 药 工 艺 学,第一章 生物药物概论 Introduction of Biopharmaceutics,1药物 Medicine(remedy) 用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。 2药品 Drug 直接用于临床的药物产品，是特殊商品。 药品应规定有适应症、用法与用量和疗程，说明毒副反应。还要有使用有效期，过期药品不准使用。,3中国的三大药源：,中国药典2005年版分一部、二部和三部。

2、药典一部收载药材及饮片、植物油脂和提取物、成方制剂和单味制剂等； 药典二部收载化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品以及药用辅料等； 药典三部收载生物制品，首次将中国生物制品规程并入药典。,化学药,中药,生物药,生化药物 微生物药物 生物制品 (P1页),生物药物 Biopharmaceutics,是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物。,(书：P1页),生物是奥妙的,水蛭（俗称蚂蝗） 水蛭素：抗凝血 苍蝇 抗菌肽,现代生物药物分四大类：,（1）重组DNA药物（又称基因工程药物） （2）基

3、因药物：以遗传物质DNA、RNA为物 质基础制造的药物 一般把采用DNA重组技术或单克隆抗体技 术或其他生物技术制造的蛋白质、抗体或核 酸类药物统称为生物技术药物(biotech drug)， 在我国又统称为生物制品。 （3）天然生物药物 （4）合成或半合成生物药物,1.重组DNA药物,2.基因药物,生物技术药物,3.天然生物药物,生化 药物,微生物 药物,海洋 药物,4.合成半合成生物药物,书： P7页,第一节 生物药物的研究范围,一、生物药物的发展简史 1. 传统生物制药技术阶段 （Traditional biopharmaceutics）指从生物材料粗加工制成粗制剂阶段。 （1）公元4世

4、纪葛洪肘后良方 海藻治瘿病 （2）公元631682，孙思邈 羊肝治“雀目” （3）神农，用蟾酥治疗创伤,2. 近代生物制药发展阶段 （Recent Biopharmaceutics） （1）脏器制药与微生物制药时期 20世纪20年代：胰岛素、甲状腺素、EAA、EFA、Vit C 20世纪40年代：青霉素 20世纪50年代：皮质激素、垂体激素 20世纪60年代：酶制剂、维生素 （2）生化制药工业时代 60年代后，生物分离工程技术 与设备广泛应用。生化产品达 600多种。,3. 现代生物制药阶段 （Modern Biopharmaceutics） 特点是以基因工程为主导，包括细胞工程、发酵工程、酶

5、工程和组织工程为技术基础。,1982.10重组Ins上市，迄今已有166多种生物技术药物投放市场，369种进入三期临床，760多种进入I-II期，2600多种处于临床前研究。,二、生物制药工艺学的内容生物制药工艺学 Biopharmaceutical process,1生化制药与微生物制药工艺； 2生物技术药物与生物制品制造工艺； 3相关生物医药产品生产工艺。 课程含三大部分内容： （1）基础篇：生物制药工艺技术基础； （2）技术篇：生物分离工程技术； （3）品种篇：重要生物药物制造工艺。,课程任务：通过学习本门课程应掌握： （1）各类生物药物制造的工艺技术基础理论、原理、工艺过程和制剂技术及

6、其质量控制。 （2）各类生物药物的来源、结构、性质与临床用途。,生物制药工艺学参考书,1. 吴梧桐：中国药科大学 生物制药工艺学第二版 实用生物制药学 现代生化药学,2熊宗贵：沈阳药科大学，微生物药物研究 生物技术制药，高等教育出版社， 1999 3褚志义 ：上海医科大学，教授，生物合成药物 生物合成药物学，化学工业出版社， 2000.,4马清钧：军事医学科学院生物工程研究所 生物技术药物，中国医药科技出版社,“人重组白细胞介素-2 ”,1994 年6月获得国家一类新药证书和试生产文号.曾获得全国科技大会重大成果奖及国家科技进步一等奖，并多次获得军队科技进步二等奖和三等奖。,5陈代杰：上海医药

7、工业研究院研究员 微生物药物学，华东理工大学出版社 6王军志：中国药品生物制品检定所副所长 生物技术药物研究开发和质量控制，科学出版社，2002年,杂志 1 中国抗生素杂志 2 药物生物技术 3 生物工程学报 4 中国生化药物杂志 5 中国医药工业杂志,第二节生物药物的性质与类别,一、生物药物的特性 （Characterization of Biopharmaceutics） （一）药理学(pharmacology)特性： 1、活性强: 体内存在的天然活性物质。 2、治疗针对性强,基于生理生化机制。 3、毒副作用一般较少，营养价值高。 4、可能具免疫原性或产生过敏反应。,(二)、理化特性： 1

8、. 含量低、杂质多、工艺复杂、收率低、技术要求高； 2. 组成结构复杂，具严格空间结构，才有生物活性。对多种物理、化学、生物学因素不稳定。 3. 活性高，有效剂量小，对制品的有效性，安全性要严格要求（包括标准品的制订）。,二、生物药物的类别,（一）天然生物药物 1微生物药物 microbial medicine （1）抗生素 （2）酶抑制剂 （3）免疫抑制剂,(书P11页),2生化药物（含海洋药物） （1）氨基酸类药物 （2）多肽类药物 （3）蛋白质类药物 （4）酶类药物 （5）辅酶类药物 （6）核苷酸与核酸类药物 （7）多糖类药物 （8）脂类药物,（书P13页）,（二）生物技术药物（新生物制

9、品） 1. DNA重组药物（DNA recombinant medicine）基因工程与蛋白质工程药物 （1）细胞因子干扰素(IFN)类药物 （2）细胞因子白介素类和肿瘤坏死因子 （3）造血功能药物 （4）生长因子类药物 （5）重组蛋白和多肽类激素 （6）心血管病治疗剂与酶制剂 （7）重组疫苗与治疗性抗体,基因工程(genetic engineering)是将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。 蛋白质工程(protein engineering) 是利用基因工程手段，包括基因的定点

10、突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。,2. 基因药物（gene medicine） (1)基因治疗 (P10页) (2)反义核酸药物 (P10页),（三）合成或半合成生物药物,第三节 生物药物的发展与展望,1生物技术药物研究进入蛋白质工程药物时代 第一代重组药物：一级结构与功能和天然活性蛋白质完全一样； 第二代重组药物：对天然产物表达物进行简单修饰，如PEG化或糖基化； 第三代重组药物时代：蛋白质工程药物，在DNA水平上，合理设计、改造、创制新型治疗蛋白。目的是提高活性；减少或消除毒副作用；提高体内外稳定性；产生新的功能特性。,猪胰岛素 牛胰岛素 赖脯人胰岛

11、素（礼来公司、速效Ins,lispro） 门冬胰岛素 （诺和诺德公司、速效Ins ,aspart） 甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins,glargine) 地特胰岛素 (诺和诺德公司、长效Ins）,人胰岛素（Insulin）,B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29 B28 A21 ;B31 ;B32 B30去除；B29修饰,3D Structure of Insulin,胰岛素二聚体（dimer）,胰岛素六聚体（hexamer ）,2. 治疗性抗体发展迅猛 FDA已批准17种治疗性抗体，在抗肿瘤、治疗风湿性关节炎，防止感染、抗血小板凝集等方面疗效突出。在369种进入临床试验的生物

12、技术药物中有75种是抗体类产品，预计2008年会有17种上市。如抗TNF嵌合抗体，TNF-R-Fc融合蛋白。,抗体人源化分为 （1）嵌合抗体：用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区，保留抗体可变区。 （2）人源化抗体:可变区中仅CDR（互补决定区）为鼠源，其FR(框架区)及恒定区均来自人源。,3. 哺乳动物细胞表达产物所占比重快速增加 2000年已批准创新生物技术药物：酵母表达产品2种，E.coli表达产品4种，分子量均在3.5KDa6KDa,表示它表达多肽有优势，而通过动物细胞表达系统22种（包括抗体、酶、凝血因子）如： TNKase(组织纤溶酶原激活剂,t-pA突变体）； EPO（促红细胞生成

13、素),4、RNA干涉（RNAi）RNA interference， 是指在生物体细胞内，dsRNA(双链RNA)引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程。 一种转录后水平的基因沉默 生物体内普遍存在 抵御外在感染的重要保护机制,siRNA (small interfering RNA) ：是一种小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer（RNAase 家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。siRNA是siRISC (RNA-induced silencing complex,由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）的主要成员，激发与之

14、互补的目标mRNA的沉默。,RNAi引发的基因沉默机制,RNAi引发的基因沉默机制,Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.,ssRNA: 单链RNA dsRNA: 双链RNA,RdRP: 依赖RNA的RNA聚合酶,Dicer:RNAase 家族中对双链RNA具有特异性的酶）,RISC: RNA-induced silencing complex RNA诱导的沉默复合体,5、基因治疗剂： DNA疫苗与基因药物发展迅速，将功能基因与表达载体重组，导入人体细胞，使其在体内表达活性蛋白，产生免疫或治疗作用。已研究成功乳腺癌DNA疫苗（可能对病

15、毒性肿瘤均可获得成功），还有黑色瘤基因治疗也取得突破（使病人晚期肿瘤消失），将病人的T-cell分离出来，用肿瘤抗原受体基因改造T-cell，再注入人体，可以对黑色素瘤产生有效清除作用。,第二章 生物制药工艺技术基础Basis of biopharmaceutical technology 第一节 生物药物提取、分离、纯化技术基础,一、生物材料的选择：1生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质2生物材料的采集与质控 （1）品种鉴定；（2）防止污染与感染； （3）选择富集目的物材料；（4）冷冻保存,二、生物活性物质物质常用的提取方法与优化,（一）几种常用提取方法 1酸、碱、盐水溶

16、液提取方法 2表面活性剂提取方法与反胶束提取方法 3有机溶剂提取 4. 双水相萃取法 5超临界萃取法,（二）提取方法与优化1.溶剂选择2.选择添加剂 保护剂； 酶抑制剂3.提取条件 温度； pH； 盐； 表面活性剂,三浓缩与干燥,1.浓缩方法： 盐析； 有机溶剂沉淀； 高分子脱水 超滤； 真空浓缩或薄膜浓缩；,（书P45页）,2.干燥：低温真空干燥；喷雾干燥；冷冻干燥,（书P47页）,四、分离纯化,1.生化制药工艺中分离纯化特点: (1) 生物材料组成复杂 (2) 目的物含量低 (3) 易变性、失活 (4) 分离方法有很大经验成分 (5) 步骤多，逐级分离 (6) 产品验证与化学上纯度概念不完

17、全相同,(书P49页),2. 分离纯化原理： P49页 (1)根据分子形状与分子大小 (2)根据电荷差异 (3)根据分子极性与溶解度大小 (4) 根据吸附特性 (5) 根据生物配基特性,3. 选择原则 （1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率 盐析，分级沉淀，萃取，超滤 （2）精制：高分辨率 多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦,第二节 微生物制药工艺技术基础一、菌种的选育与保藏,1自然选育 依据自发突变原理，通过不断分离筛选，除去衰变菌落，选择高产菌，达到强化、复壮、稳定生产目的。 方法：（1）平板划线法 （2）稀释平板法,2诱变育种 （1）诱变处理:化学诱变；物理诱变

18、 （2）代谢调节选育 （3）基因重组技术改变代谢途径 （4）原生质体融合,突变株筛选一般进程如图所示,第三第四轮同第二轮,第三第四轮同第二轮,3菌种保存,（1）保存目的：防止退化 （2）菌种退化检查方法 （3）菌种退化防止方法 （4）菌种保藏方法： 斜面低温保存 液体石蜡封藏法 甘油冷冻法 冷冻干燥法 液氮保藏法,二、发酵工程技术基础,发酵工程：单细胞纯培养工业化过程，以产生大量目的物。1液体培养深层发酵2固体培养浅盘培养,图1 L-Lys生产过程工艺设备图,第三节 生物技术药物制造技术基础一、重组DNA技术原理,1基因工程操作过程：（1）获得目的基因； （2）构建DNA重组体； （3）将重组

19、体导入宿主细胞； （4）工程菌的克隆与鉴定； （5）目的基因扩增与蛋白表达。,2基因工程药物制造过程,二、基因工程主要操作技术,1目的基因的获得 （1）cDNA文库 纯化目的mRNA，逆转录成cDNA mRNA的分离 cDNA第一链的合成 cDNA第二链的合成 cDNA与载体连接 转染或转化 筛选目的克隆,目的基因的获得：cDNA文库,（2）PCR法或逆转录PCR（RT-PCR） 典型PCR反应包括 模板变性 94以上（12） 退火 5055（12） 延伸 72（12） 在高温聚合酶作用下， 以DNA单链为模板， 由引物起始从53 延伸。,（3）化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，

20、如链长在 60bp100bp可用化学合成法直接合成DNA。,2DNA重组体的构建 根据宿主菌不同，选择基因载体（Vector） （1）E.coli质粒非表达型 pBR322，表达型pUC，实用型pBV220，PET系统，噬菌体DNA作为载体，非表达型gt10，表达型gt11。 （2）芽孢杆菌 pUB110 pE194和pC194 （3）链霉菌 pIJ101 pSG5 cDNA与载体连接方法 同聚尾连接法 人工接头连接法,3重组体的表达系统 （1）原核表达系统 E.coli；芽孢杆菌Bacillus；链霉菌Streptomyces 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，

21、易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性,（2）真核表达系统 酵母表达 毕赤酵母（pichia psatoris）受甲醇诱导 优点：易培养无毒性，易高密度发酵（100g/L），高表达，成本低，产物可糖基化，有分泌表达。 动物细胞 哺乳动物细胞CHO（仓鼠细胞） 昆虫细胞家蚕细胞,4表达产物的纯化,包含体 inclusion bodies: 大部分是表达产物，（还有细胞蛋白和膜蛋白）一级结构正确、无活性，不溶于水，可用变溶剂SDS尿素，盐酸胍溶解，再稀释透析除去变性剂，使其复性。,为防止或减少包含体的形成常用方法： （1）降低培养温度 从37降到30可显著降低包含体形成率。 （2）

22、以硫氧还原蛋白为载体进行融合表达。 硫氧还原蛋白是E.coil的一种同源蛋白，定位于粘附区，富含-SH,可保目的蛋白不发生分子错误折叠，是一种热稳定蛋白，表达产物聚集于粘附区，通过振扰提取使产物进入介质中，再酶解就得到目的蛋白。,三、酶工程制药技术基础,1、酶工程(enzyme engineering) 研究内容 （1）酶的发现、分离纯化与生产应用。 （2）酶与细胞的固定化技术与酶反应器。 （3）生物酶工程：以基因工程技术和蛋白质工程技术研究酶工程。 （4）抗体酶、模拟酶 合成酶及酶的人工设计。,（书P102）,2、固定化酶 （1）固定化稳定性提高 （2）可重复使用、提高使用效率、降低成本 （

23、3）提高强度，便于连续、自动、规模化生产 （4）便于产物的分离、纯化,酶的固定化技术和固定化酶,3、制备方法： （1）吸附法：分为物理吸附法和离子交换吸附法 （2）包埋法：将酶或细胞定位于凝胶高聚物网络中，如卡拉胶，海藻胶，聚丙烯酰胺 （3）共价键结合法：酶分子与载体分子，通过化学偶联使酶与载体共价结合。 （4）交联法：用双功能试剂 将酶与载体交联固定化,图: 酶固定化方法示意 1. 离子结合 2.共价结合 3.交联 4. 聚合物包埋 5. 疏水作用 6. 脂质体包埋 7. 微胶囊,第四节 生物制药工艺中试放大设计一、中试放大目的与规模,1目的： （1）建立稳定工艺、大批量制备足量合格产品，供

24、应临床前与临床研究； （2）研究工艺参数制定工艺规程和检定规程，为正式生产提供工艺参数，保证能在以后生产中应用。,2规模： 中试是由小试转入工业化生产的过渡性研究，是取得成功产业化的关键。,3、中试放大时应具备的条件 （1）有稳定的工艺：收率，质量可靠 （2）操作条件基本确立 （3）已建立中间品和成品分析方法 （4）生物材料已鉴定 （5）物料平衡、三废处理已基本解决 （6）中试规模、产品产量，规模已确定 （7）安全生产已有方案,4中试放大要解决的问题 （1）原辅材料规格 （2）设备选型与材质选用 （3）反应条件 （4）原辅料中间品、产品质控标准与检定方法 （5）下游工艺优化与稳定制造规程的制定

25、,二中试放大方法与总结内容,1、放大方法 （1）经验放大 （2）相似放大 （3）数学模型放大 2、总结内容： （1）确定工艺路线，优化工艺条件，制定制造规程。 （2）制定岗位操作、投产 （3）进行材料衡算 （4）安全生产与处理 （5）原辅料及产品质控方法与标准测定。 （6）产品规格标准制定 （7）消耗定额，成本核算，工时，生产周期计算。,1组合生物合成 2药物基因组学 3药物蛋白质组学 4蛋白质工程 5基因治疗与基因疫苗 6糖基化工程 7先导物高通量筛选与药物合理设计（rational drug design） 8核酶、抗体酶、干扰RNA 9药物生物信息学 10功能抗体与人工智能技术和虚拟人技术