第二章 微生物发酵产酶.ppt

1、第二章 微生物发酵产酶,重点： 微生物细胞中酶生物合成的调节，酶生物合成的模式，酶发酵生产的工艺条件及其控制，提高酶产率的措施，固定化微生物发酵产酶。,微生物发酵产酶 是指在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶，其技术包括培养基和发酵方式的选择，以及发酵条件的控制管理等方面的内容。,在一定的条件下，酶可以催化各种生化反应，并且具有催化效率高、转一性强和作用条件稳定等特点，所以酶在医药、食品、轻工、化工、环保、能源和生物工程等领域广泛应用。,微生物发酵产酶的工艺流程,产酶菌种的筛选,含菌样品的采集,菌种分离,产酶性能测定及复筛等全过程。,一个优良的产酶菌种应具备以下几点： a

2、繁殖快,产酶量高，有利于缩短生产周期 b 容易培养和管理 c 产酶性能稳定，菌株不易退化，不易受噬菌体侵袭 d 产生的酶容易分离纯化 e 安全可靠、无毒性,微生物酶的类型 1.胞外酶：细胞内合成而在细胞外起作用的酶。包括位于细胞外表面或细胞外质空间的酶，也指释放入培养基的酶。 大多是水解酶（如淀粉酶、蛋白酶、 纤维素酶、果胶酶），是微生物为了利用环境中的大分子而释放到细胞外的。,2.胞内酶：指合成后仍留在细胞内发挥作用的酶，这些酶在细胞内常与颗粒体结合并有着一定的分布。 如线粒体上分布着三羧酸循环酶系和氧化磷酸化酶系，而蛋白质合成的酶系则分布在内质网的核糖体上。,酶的发酵生产方式 固体培养发酵

3、:把菌种接入固体培养基中,保温数天,用水或缓冲液浸泡培养基,将酶抽提,测定酶活力,这种方法主要适用于霉菌. 适合于传统发酵工艺及乡镇企业用来生产比较简单的产品。,液体深层发酵:采用液体培养基,置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下，进行发酵，生产得到所需的酶. 适合于大规模工业化生产。,液体深层发酵优点 液体悬浮状态是很多微生物的最适生长条件 在液体中菌体、营养物、产物易于扩散，便于控制 液体输送方便，易于机械化操作 占地面积小，生产效率高，易进行自动化控制 产品易于提取和精制等,固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵 前者是20世纪70年代后期，在固定化酶的基

4、础上发展起来的发酵技术。是固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。 后者是20世纪80年代中期发展起来的技术。是固定在载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的原生质体。,（一）RNA的生物合成-转录(transcription),定义 以DNA为模板，以核苷三磷酸为底物，在RNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNA分子的过程。,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promotor),终止子(terminator),RNA链的延伸图解,启动子：在DNA分子上，RNA聚合酶识别和结合的 核苷酸序列，

5、即转录作用起始的部位。 终止子：DNA上的一段核苷酸序列，给RNA聚合酶 提供终止转录的信号，也称终止序列。 操纵子：转录的功能单位。 （调控系统和结构基因的综合）。,（2）转录启动区：,DNA,（3）转录终止子： 对真核生物转录的终止子信号和终止过程了解甚少。但在高等真核生物的细胞中，mRNA在靠近3端区有一段非常保守的序列 AAUAAA，这一序列为链的切断和poly(A)化提供了某些终止信号。,不同细胞核糖体的组成,核蛋白体的组成,小亚基貌似一个动物胚胎，由头部、基部和平台组成，平台与头部之间有一个裂隙；大亚基很像一个沙发，有一个柄、一个中央凸出部和一个脊； 二者组装成核糖体时，小亚基头部

6、与大亚基凸出部之间形成一个隧道，在蛋白质合成中mRNA很可能从这里通过。,大肠杆菌核糖体三维结构模型,蛋白质的合成过程 （大肠杆菌）,氨基酸的活化 肽链合成的起始 肽链的延伸 肽链合成的终止与释放,（一）基因调控理论 Jacob and Monod的操纵子学说（operon theory）,调节基因(regulator gene)： 可产生一种组成型调节蛋白(regulatory protein) ，通过与效应物(effector) （包括诱导物或辅阻遏物）的特异结合而发生变构作用，从而改变它与操纵基因的结合力。 调节基因常位于调控区的上游。,(二) 酶合成调节的类型 1.诱导 (induct

7、ion) 组成酶：细胞固有的酶类。 诱导酶：是细胞为适应外来底物或其结构类似 物而临时合成的一类酶。 2.阻遏 (repression) 分解代谢物阻遏(catabolite repression) 反馈阻遏(feedback repression),（三）酶合成的调节机制 1. 酶合成的诱导 加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行。 酶合成诱导的现象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； 透过酶；硫代半乳糖苷转乙酰酶。 实验：（1）大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内无上述三种酶合成； （2）大肠杆菌生长在乳糖培养基上时，细胞内有上述三种酶合成； 表明菌体生物合成的经济原则：需要时

8、才合成。,2.末端产物阻遏 由某代谢途径末端产物的过量累积引起的阻遏。 酶合成阻遏的现象： 实验： （1）大肠杆菌生长在无机盐和葡萄糖的培养基上时， 检测到细胞内有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培养基中加入色氨酸，检测发现细胞内色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，体现了菌体生长的经济原则:不需要就不合成。,色氨酸操纵子酶的阻遏,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,阻遏蛋白不能与操纵基因结合， 结构基因表达,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,代谢产物与阻遏蛋白结 合，使之构象发生变化 与操纵基因结合，结构基 因不能表达,酶的诱导和阻

9、遏操纵子模型,B.有活性阻遏蛋白加诱导剂,A.有活性阻遏蛋白,C.无活性阻遏蛋白,D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂,酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比,3.分解代谢物阻遏,指细胞内同时有两种分解底物（碳源或氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关酶合成的现象。 分解代谢物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的结果，而是通过甲碳源（或氮源等）在其分解过程中所产生的中间代谢物所引起的阻遏作用。,分解代谢物阻遏现象： 实验：细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基上生长，优先利用葡萄糖。待葡萄糖耗尽后才开始利用乳糖，产生了两个对数生长期中间隔开一个生长延滞期的“二次生长现象”(

10、diauxie或biphasic growth）。,这一现象又称葡萄糖效应，产生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此调节基因的产物是环腺苷酸受体蛋白（CRP）,亦称降解物基因活化蛋白（CAP）。,分解代谢物阻遏,R,LacZ,LacY,Laca,mRNA,CAP基因,结构基因,T,CAP,O,CAP结合部位,RNA聚合酶,T,cAMP -CAP,P,CAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）,使CAP呈失活状态,08/10/6，瑞典， “诺贝尔路号”的卡罗林斯卡医学院“诺贝尔论坛楼”内举行，诺贝尔奖评审委员会成员走上讲台，宣

11、布了08年诺贝尔生理学或医学奖得主。,他们分别在宫颈癌致病因子和艾滋病病毒研究上有突出成就（德国科学家因发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌获此殊荣，两名法国科学家因发现人类免疫缺陷病毒获此殊荣。） 诺贝尔奖正式颁奖典礼每年12月10日在诺贝尔逝世纪念日这一天分别在瑞典首都斯德哥尔摩和挪威首都奥斯陆举行。 本年度诺贝尔奖各奖项得主将独享或分享总额为万瑞典克朗（约合万美元）的奖金。,07/10/8，瑞典，诺贝尔生理学和医学组委会及评审委员会秘书汉斯约纳沃博士宣布2007年诺奖医学奖得主,他们在改造活体内特定基因的“基因靶向” 技术等方面做出了奠基性贡献。 基因靶向技术是指利用细胞脱氧核糖核酸(DNA)

12、可与外源DNA同源序列发生同源重组的性质，定向改造生物某一基因的技术。 它可用于有针对性地寻找某些遗传性疾病的疗法。,第二节 常用的产酶微生物,一、 用于酶的生产的细胞必须具备以下几个条件： a 产酶量高 b 容易培养和管理 c 产酶稳定性好 d 利于酶的分离纯化 e 安全可靠、无毒性,细菌的结构,细菌的菌落 定义：单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时， 会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子 细胞群体。 特征：大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等。 功能：每种细菌在一定条件下所形成的菌落可以作为菌 种鉴定的重要依据。,枯草杆菌,放线菌菌落及形态,放线菌的分布 放线菌在自然界分布很

13、广，在土壤、堆肥和湖底、河底的淤泥等处，尤其在土壤中种类和数量很多。 放线菌的繁殖 主要通过形成无性抱子形式进行无性繁殖，成熟的生孢子或孢囊孢子在适宜环境里发芽形成新的菌丝体。,链霉菌,酵母菌 主要分布于含糖质较多偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶片上，果园土壤中，石油酵母多分布在油田周围的土壤中。 多数为腐生，常以单个细胞存在，以发芽形式进行繁殖。,啤酒酵母菌,霉菌 分布很广 土壤、空气、水和生物体内大量存在 偏酸性环境中多数以无性孢子繁殖为主。,菌种的来源 根据需要直接从有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。,新菌种分离与筛选的步骤 定方

14、案：先要查阅资料了解所需菌种的生长培养特性 采样：有针对性地采集样品 增殖：通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养 分离：利用分离技术得到纯种 发酵性能测定：进行生产性能测定,采样对象 一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主， 富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多， 采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。,从自然界筛选,采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 采土方式：在选好适当地点后，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记。记录采样时间、地点、环境条件等。,增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量

15、上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。,培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。 纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。,筛选 采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。,毒性试验 据国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须做毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。,人工控制代谢的手段： 改变微生物遗传特性(遗传学方法）； 控制发酵条件（生物化学方法）； 改变细胞膜透性；,微生物发酵的一般工艺流程,一、细菌活化与扩增培养 活化

16、 一般保存于冷冻管及砂土管或冰箱中的优良生产菌种和选育的新菌种，在正式使用前要先接种到新鲜斜面培养基上，在一定的条件下进行培养，使细胞的生命活性得以恢复。,扩大培养 是指菌种活化后经过摇瓶或种子罐逐步扩大培养，获得一定数量和质量的纯种的全过程。,发酵的流程,空气,空气净化处理,保藏菌种,斜面活化,扩大培养,种子罐,主发酵,碳源、氮源、无机盐等营养物质,灭菌,产物分离纯化,成品,1.温度 温度对发酵的影响是多方面的，主要表现在对细胞生长、产物形成、发酵液的物理性质和生物合成方面。 最适发酵温度是适合菌体生长、又适合代谢产物合成的温度，它随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而改变。,2.

17、pH 发酵过程中pH的变化取决于所用的菌种、培养基的成分和培养条件。 微生物生长和生物合成都有其最适和能够耐受的pH范围，大多数微生物生长的最适pH6.3-7.5，霉菌和酵母生长的最适pH4-6，放线菌生长的最适pH7-8。,几种抗生素发酵的最适pH范围,3.溶解氧浓度 对于好氧发酵，溶解氧浓度是最重要的参数之一。 好氧性微生物深层培养时，需要适量的溶解氧以维持其呼吸代谢和某些产物的合成，氧的不足会造成代谢异常，产量降低。,四、提高酶产量的措施 在酶的发酵生产过程中，为了提高酶的产量，除了选育优良的产酶细胞外，还可以采取一些与酶发酵工艺有关的措施，例如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂

18、等。,2.控制阻遏物浓度 微生物酶的生产受到代谢末端产物的阻遏和分解代谢物阻遏的调节。为避免分解代谢物的阻遏作用，可采用难于利用的碳源，如在-半乳糖苷酶的生产中，只有在培养基中不含葡萄糖时，才能大量诱导产酶。,3.添加表面活性剂/(产酶促进剂） 改变细胞的通透性或对酶分子有一定的稳定作用如在霉菌的发酵生产中添加 1%的吐温可使纤维素酶的产量提高几倍到几十倍。,第四节 酶发酵动力学 主要研究发酵过程中细胞生长速度，产物生成速度，基质消耗速度以及环境因素对这些速度的影响等。,一、细胞生长动力学 研究细胞生长速率以及外界环境因素对细胞生长速率影响的规律。,营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间

19、的动力学关系：Monod模型 :比生长速率（1/h） （specific growth rate） m：最大比生长速率（1/h） S：营养物浓度（生长限制基质浓度） 克/L Ks：莫诺德常数或饱和常数或营养物利用常数克/L，或 mol/L,酶生产中最理想的合成模式： 延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。 对于： 同步合成型：提高对应的mRNA的稳定性，如降低发酵温度 。 滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使 酶的合成提早开始。 中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方 面努力。,三

20、、 产酶动力学 主要研究在发酵过程中细胞产酶速度以及各种环境因素对产酶速度的影响规律。,产酶动力学根据研究的着眼点不同，可分为： 宏观产酶动力学（非结构动力学）:研究群体细胞的产酶速度及其影响因素（整个发酵系统的角度）。 微观产酶动力学（结构动力学）:研究细胞中酶合成速率及其影响因素（细胞内部的角度）。,第五节 固定化微生物细胞发酵产酶 又称固定化活细胞或固定化增殖细胞，用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围内生长、繁殖和新陈代谢的细胞. 在发酵生产淀粉酶,蛋白酶,纤维素酶等胞外酶方面取得了成功.,一、固定化细胞发酵产酶的特点1.提高产酶率 2.可在高稀释度下连续发酵 3.基因工程菌的质粒稳定,不易丢失;4.发酵稳定性好5.缩短发酵周期,提高设备利用率;6.产品容易分离纯化;7.适于胞外酶等胞外产物的生产.,二、固定化细胞发酵产酶的工艺条件控制与游离细胞发酵大同小异,需特别注意的几个问题:1.固定化细胞的预培养先预培养,使固定在载体上的细胞生长繁殖,长好后,再用于发酵产酶.,2.溶解氧的供给由于受到载体的影响,使氧的供给成为主要的限制性因素.解决办法:(1)加