军医大学免疫教程二：基因工程Ig.ppt

1、免疫球蛋白基因 和基因工程抗体 Immunoglobulin Genes and Genetically Engineered Antibodies,免疫球蛋白基因 Immunoglobulin Genes,免疫球蛋白 (Immunoglobulin, Ig) 抗体 (antibody) 分泌型Ig (secreted Ig, SIg) 膜型Ig (membrane Ig, mIg),德国细菌学家Behring 日本学者Kitasato 抗毒素、免疫血清疗法 首届生理学和医学诺贝尔奖,一、基本概念,人工制备的抗体 多克隆抗体 (polyclonal antibody) 单克隆抗体 (monoc

2、lonal antibody) 基因工程抗体 (genetic engineering antibody),Milstein、Kohler、Jerne 单克隆抗体制备技术 1984年获诺贝尔奖,(一)基本结构：Ig单体由两条重链和两条轻链经二硫键连接而成。,二、免疫球蛋白的结构,Edelman与Porter 解析Ig结构 1972年获诺贝尔奖,(k或),Ig的可变区和恒定区 重链可变区 (variable region of heavy chain, VH) 轻链可变区 (variable region of light chain, VL),可变区(variable region, V),重

3、链恒定区 (constant region of heavy chain , CH) 功能区: CH13(IgG、IgA、IgD) CH14(IgM、IgE) 轻链恒定区 (constant region of light chain, CL),恒定区(constant region, C),VH,免疫球蛋白V区和C区结构示意图,高变区 (hypervariable region, HVR)又称 互补决定区 (complementarity-determining region, CDR) VH和VL各有3个CDR(CDR13), 共同组成 Ig的抗原结合部位。 骨架区(framework r

4、egion, FR) VH和VL各有4个FR(FR14),免疫球蛋白CDR和FR结构示意图,(二)Ig的水解片段,1.木瓜酶水解Ig 2个相同的抗原结合片段 (fragment of antigen-binding, Fab) 1个可结晶片段 (fragment crystallizable, Fc),2.胃蛋白酶水解Ig 1个F(ab)2 和1个pFc,(三) 功能区或结构域(domain) 免疫球蛋白超家族 (immunoglobulin superfamily, IgSF),胚系Ig基因在基因组中以基因簇(gene clusters)的形式存在。 重链基因簇(IGH)：含V, D, J,

5、 C基因片段 IGHV, IGHD, IGHJ, IGHC k轻链基因簇(IGK)：含V,J,C基因片段 IGKV, IGKJ, IGKC 轻链基因簇(IGL)：含V,J,C基因片段 IGLV, IGLJ, IGLC,三、免疫球蛋白的基因,人Ig基因片段 基因片段 Ig基因 V D J C IGH 95(50) 23 9(6) 11(9) IGK 90(60) 0 5 1 IGL 60(30) 0 7 7(4),Tonegawa 1987年获诺贝尔奖,重排序列信号（RSS） rearrangement singnal sequance,Ig基因重排和表达,等位基因排斥(Allelic excl

6、usion ) 一旦VH-DH-JH重排成功，并且得到功能性表达，会抑制另一条同源染色体上等位基因的重排。,同型排斥(isotype exclusion) V或V基因只有一个能重排、表达， V基因首先重排并抑制V基因的重排;只有当V基因重排不成功,V基因才能进行重排 。,转换区 switch region,基因工程抗体(genetic engineering antibody),抗体药物销售趋势图,一、鼠单抗人源化,人源化抗体(humanized antibody) 免疫原性降低，对各种水解酶的抵抗力增强；可根据需要使抗体连接用于治疗或诊断的相应物质，以增强基因工程抗体的治疗效果或提高诊断的敏

7、感性。,用人抗体的恒定区取代鼠单抗的恒定区，使鼠 单抗恒定区人源化，但保留鼠单抗的可变区。,(一)人-鼠嵌合抗体 (human-mouse chimeric antibody),Fab和F(ab)2嵌合抗体： 将鼠的功能性抗体轻链和重链可变区 基因分别与人抗体的链和重链CH1恒定 区基因重组，克隆到表达载体中。 主要通过哺乳类细胞表达，最常用的 是小鼠骨髓瘤细胞系和CHO细胞 。,最大限度地减少鼠单抗的异源性，又能使人单 抗获得鼠单抗的特异性。,(二)CDR移植抗体(CDR-grafted antibody) 人改型抗体(human reshaped antibody),二、单价小分子抗体,优

8、点： 分子量小而穿透力强； 不含Fc段，可减少副作用； 能够在大肠杆菌等原核细胞中表达，降 低生产成本； 在体内半衰期较短，廓清快； 基因操作较容易，可进一步经过改造， 制备其他类型的基因工程抗体。,由重链Fd段和完整的轻链通过一个链间二硫 键连接形成的异二聚体，只有一个抗原结合部位。,(一)Fab,(二)Fv和ScFv(single-chain Fv),Fv段由VH和VL籍非共价键结合，是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段，其稳定性差。,ScFv： VH-linker-VL或VL-linker-VH Linker一般含有1415个氨基酸残基，应用最广的是含有重复出现的4个甘氨酸和一个丝

9、氨酸的(Gly4Ser)3 优点： 比Fv稳定； 保持单价结合抗原的亲和力； 分子量小，组织穿透性较强。,(三)单区抗体(single domain antibody)及 最小识别单位(minimal recognition unit，MRU),单区抗体是抗体分子中单独具有结合抗原能力 的重链可变区(VH)， MRU是来自CDR的短肽，可 模拟亲本抗体的抗原结合活性,单区抗体的优越性： 穿透力强，有利于实际应用； 不需将VH和VL基因分别克隆和进行正确 配对，制备时操作简便； 只有VH而不需与VL相互作用，稳定性较 Fv和ScFv更好； 其抗原结合部位的构象较为特殊，VH抗 体CDR襻插入抗原

10、表面的凹陷中，这对 于制备酶抑制性抗体有重要意义。,MRU的优越性： 穿透能力强，半寿期短，显像时本底低，适用于临床显像诊断。,三、双价和多价小分子抗体,(一)化学交联法 DTNB、O-PDM使2个ScFv在体外相连接，形成双价小分子抗体。 易引起抗体分子的抗原结合部位的结构改变，降低抗体的活性。,(二)二聚化结构域融合法 在单价小分子抗体的3端连接具有二聚 化倾向的结构域(dimerization domain) 亮氨酸拉链 (leucine zipper) a螺旋束 (helix bundle) Ig的CH3区 链亲和素,(三)接头长度控制法,双链抗体(diabody) 将ScFv的接头缩

11、短，使两个ScFv分子间的VH和VL配对，发生非共价键结合，形成双价小分子抗体。 构建时操作简单，具有良好的性能和应用前景。 三链抗体(triabody) 四链抗体(tetrabody),双链抗体 三链抗体 四链抗体,四、双特异性抗体 (bispecific antibody, BsAb),(一)化学偶联方法 SPDP、DTNB、O-PDM等化学交联剂可将两个不同抗原特异性的全抗体分子或其功能性片段连接成BsAb。,化学偶联方法： 简便快速，产物容易纯化 易造成抗体分子的抗原结合部位发生改变，从而降低其活性 交联剂的致畸和致癌作用 主要用于体外的 实验研究。,(二)杂交-杂交瘤方法 (hybr

12、id-hybridoma),四源杂交瘤(quadroma)： 使两株各自分泌不同特异性单抗的 杂交瘤细胞再融合 三源杂交瘤(trioma)： 用一株杂交瘤细胞与 免疫后的脾细胞融合,由于两套重链和轻链之间可重新随机组合，而目的BsAb仅占20左右，所以必须从大量相似的Ig中费时费力地筛选出目的BsAb； 多倍体杂交瘤的稳定性差，必须经常对杂交瘤进行克隆； 分泌抗体的量少，且活性低，增加纯化难度； 人源杂交瘤技术存在诸多问题，鼠源性BsAb用于人体会出现HAMA，故应用受到限制。,杂交-杂交瘤方法的主要缺点：,(三)基因工程方法,主要是以Fab、Fv和ScFv等抗体分子片断为基本构件，用基因工程

13、方法制备BsAb。 1.末端半胱氨酸残基(Cys)共价交联 在两种不同ScFv或带铰链区的Fab段的羧基端分别接上半胱氨酸残基(SerCys或Gly4Cys),2.链间连接肽相连 单链双特异性抗体 (single-chain bispecific antibody, scBsAb) 在DNA水平用一个柔性较强、长度合 适的肽段将两个ScFv首尾相接，常用的是 Gly4Ser，而长肽链可用 (Gly4Ser)3，形成双 ScFv的单肽链，经过 正确折叠成为BsAb。,3.二聚化结构域融合法,4.构建双特异性双链抗体 (bispecific diabody) 将抗体A的VH和抗体B的VL用一短的接

14、头连接成一条杂合ScFv，同理将抗体A的VL和抗体B的VH连接成另一条杂 合ScFv，构建含有这两条链 的双顺反子表达载体，当两 者同时表达时，由于短接头 的限制，使两个不同特异性 抗体的轻链可变区和重链可 变区交叉组合。,五、抗体融合蛋白,(一)含Fv段的抗体融合蛋白 1.免疫靶向性抗体融合蛋白 将毒素、酶、细胞因子等生物活性蛋白与含Fv段的针对肿瘤的抗体片段融合，应用于靶向治疗恶性肿瘤。,重组免疫毒素 (immunotoxin) 抗体分子与毒性蛋白的偶联物 常用毒素： 细菌来源的毒素 假单胞菌外毒素和白喉毒素 植物来源的毒素 蓖麻毒素、肥皂草素及商陆抗病毒蛋白,毒素的细胞毒性作用使得所构建

15、的免疫毒素不能在真核细胞表达，而用大肠杆菌进行表达制备。 植物毒素难于在原核细胞中表达，故很少用来构建抗体融合蛋白，而多采用化学交联的方法制备抗体与毒素的偶联物。 毒素都是异源蛋白，具有免疫原性，进入人体后可诱导产生人抗异源毒素的抗体(human anti-toxin antibody, HATA)。,免疫细胞因子(immunocytokine) 用含Fv的针对肿瘤的抗体片段与细胞因子融合，靶向治疗肿瘤，降低毒副作用。较常见的有抗体-IL-2、抗体-IL-12、抗体-GM-CSF、抗体-TNF-a等。,抗体-酶融合蛋白 抗体导向的酶-前药治疗(antibody- directed enzyme

16、 prodrug therapy, ADEPT) 抗体-核酸酶融合蛋白 抗体-溶栓剂融合蛋白,2.免疫桥连性抗体融合蛋白 由一个抗体分子与另一个具有特异 靶向作用的分子构建成融合蛋白，可同 时结合效应细胞与靶细胞，使两种不同 细胞发生桥连。 抗CD3-EGF,(二)含Fc段的抗体融合蛋白,免疫粘附素(immunoadhesin)： 用抗体Fc段与细胞表面某些具有特异识别及结 合功能的蛋白分子构建的融合蛋白。 通过受体与配体间相互作用产生效应 发挥Fc段的免疫功能： 调理吞噬作用 ADCC效应 激活补体 与蛋白A或抗Ig结合，利于纯化和检测 延长融合蛋白的半寿期(如CD4-Fc融合蛋白),六、抗

17、原化抗体,将特定抗原分子表位的编码基因序列 插入抗体重链可变区的CDR3部位，表达 出具有该抗原表位的氨基酸组成和构象以 及免疫原性的重组抗体。 应用： 干扰或阻断作用 制备新型疫苗,七、细胞内抗体(intrabody),将携带小分子抗体基因的表达载体导入细胞内，在细胞内特定部位表达的抗体分子，结合细胞内的靶抗原后能影响靶抗原的生物学活性。 为了达到不同的目的效应，可以对小分子抗体基因进行修饰，使其表达于细胞的不同部位，当抗体与不同部位中的靶分子结合后，可以产生不同的效应。,应用前景： 分子功能的研究 IL-2Ra ， erbB2 基因治疗 抗肿瘤基因治疗 抗艾滋病的基因治疗 针对HIV外壳蛋

18、白gpl20、调节蛋白Tat 和Rev、逆转录酶、整合酶 存在的问题,依赖于PCR技术、抗体分子在大肠 杆菌的功能性表达以及噬菌体展示技术 (phage display technology)而发展起 来的抗体工程技术。,抗体库技术：,一、噬菌体抗体库技术,(一)丝状噬菌体(Filamentous phage) 纤丝状病毒颗粒 基因组是单链环状DNA 复制型DNA是病毒基因组DNA增殖的中 间体，可被用作基因克隆的载体 基因组共编码10种蛋白 外源蛋白的基因与基因或基因融合 表达在噬菌体表面,(二)噬菌体展示技术 将蛋白分子或肽段的基因克隆到丝状噬菌体的基因组DNA中，与噬菌体的外壳蛋白形成融合蛋白，在噬菌体的表面表达，使特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内，通过筛选噬菌体表面的能结合特定配体的蛋白，即可获得相应的编码基因。,噬菌体展示技术“吸附一洗脱一扩增” 的过程,优越性