《DNA的复制和修复》PPT课件.ppt

1、第30章 DNA的复制和修复,本章主要内容,一、DNA的复制 DNA聚合酶 复制的过程 复制的特征 二、聚合酶链式反应 （PCR） 三、DNA的损伤修复,DNA聚合反应的特点：,需要模板指导 以四种dNTP为底物 需要有引物，3-羟基存在 DNA链的生长方向是5 3 产物DNA的序列与模板互补,DNA聚合酶（DNA polymerase ）,温故:,体内,终止阶段（Termination ）,延伸阶段（ Elongation）,起始阶段（Initiation）,DNA复制的过程,温故:,体内,DNA复制的特征,半保留复制 （semiconservative replication）,半不连续复

2、制 （semidiscontinuous replication）,温故:,体内,背景介绍： 获得大量的DNA 化学合成 基因重组,体外,1983年，美国Cetus公司的Kary Mullis,发明了聚合酶链式反应（PCR）。,二、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR), （一） 定义 （二） 发明 （三） 基本原理 （四） 特点 （五） 发展和应用,知新：,体外,P 674,（一）PCR的定义,聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR)： 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法， 故又称为基因的体外扩增法。,

3、体外,（二） PCR的发明,故事发生在1983年4月,72,94,55,PCR循环,在试管中模拟细胞内DNA的复制,DNA聚合酶,美国黄石国家公园的温泉,嗜热水生菌,Taq DNA聚合酶,耐高温DNA聚合酶,The Nobel Prize in Chemistry 1993,for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry,Kary B. Mullis (1944-) La Jolla, CA, USA,Michael Smith (1932-) University of British C

4、olumbia Vancouver, Canada,（三）PCR的基本原理,首先使DNA变性,两条链解开, 然后使引物与模板退火,二者碱基配对; DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物,在引物的引导下合成与摸板互补的新链。 重复这个过程， DNA以指数方式扩增。,体外,三个阶段,高温（9095） 变性(Denaturation),循环（n次）,低温（4060） 退火(复性) (Annealing),适温（7075） 延伸 (Elongation),动画,n次循环后DNA序列扩增的数量,No. of No. Amplicon Cycles Copies of DNA 1 2 2 4 3 8 4 1

5、6 5 32 6 64 20 1,048,576 25 33,554,432 30 1,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,8 cycle = 256 Amplicon,扩增的公式：Y=( 1+X ) n 其中：Y产量；X扩增效率； n循环次数； 设X=60%， n=30， Y =1.33106,（四）PC

6、R的特点,特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低,发展： PCR仪的变迁、PCR的种类 应用： 生物学、医学,（五）PCR的发展和应用,PCR仪,PCR仪的变迁,不对称PCR（Asymmertric PCR） 嵌套式PCR（Nested PCR） 原位PCR（In situ PCR） 逆转录PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR） 实时荧光定量PCR (Real time fluorescent quantitative PCR，FQ PCR) 反向PCR（Inverse PCR） 重组PCR（Recombinant PCR） 多重等位基因PCR（

7、Multiplex allele PCR） Anchored PCR; Long fragment PCR; DDRT-PCR; LM-PCR; RACE; Flow chip PCR; Immuno PCR; LP-PCR; NASBA; RFLP-PCR; AFLP-PCR; RAPD-PCR; SSCP; TAS,PCR的种类,.,PCR的应用,生物学 基因克隆、人工基因构建、DNA序列测定、 基因定点突变、基因型（突变）检测、 SNP分析、遗传背景分析、生物物种鉴定、系统进化研究、 基因表达量研究（Real-time PCR） 、 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE） 医学

8、 临床医学：遗传病诊断、疾病基因检测（肿瘤诊断）、 病原体检测 法医学： 个体识别、性别鉴定、亲子鉴定,限制性片段长度多态性PCR法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）检测,Ras基因,突变,正常人,患者,Example,电泳,甲型H1N1流感病毒 原理：实时荧光定量逆转录PCR技术 逆转录：RNA cDNA 耗时：两个半小时,病原体检测,Example,现 嫌1 嫌2 嫌3,在法医鉴定中的应用 : 个体识别,Example,试比较DNA复制与PCR之间的差异,思考题：,三、 DNA的损伤修复,（一） DNA的损伤 化学损伤（脱氨剂、烷化剂） 物理损伤（紫外线的作用） 结果：碱基改变

9、或丢失、骨架中的磷酸二酯键的断裂、螺旋链形成交联等。,（二） 修复系统的种类,错配修复（ mismatch repair） 直接修复（ direct repair） 切除修复 碱基切除修复（ base-excision repair） 核苷酸切除修复（ nucleotide-excision repair） 重组修复（recommbination repair ） 易错修复（error-prone repair）,2.1 错配修复 （ mismatch repair）,修复在复制中的碱基错配 只能校正新合成的DNA 新合成的链中GATC中的A：未被甲基化。 错配碱基与GATC之间间隔的DNA序

10、列被核酸外切酶切除。,E. coli 的 Mut L、 MutS、和MutH蛋白识别错配碱基对，并在GATC 序列处产生1个缺口，包括1kb的片段,MutS,MutL,MutH,A proposed model for methyl-directed mismatch repair in E. coli cells.,2.2 直接修复（direct repair）,胸腺嘧啶二聚体,胸腺嘧啶二聚体,光复活修复（Photoreactivation repair）： 光复活酶催化的修复，也称为直接修复（Direct repair）。由可见光激活光复活酶，分解因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体，使损伤部位

11、得以修复的机制。这种修复分布很广，但不存在于高等哺乳动物中。,修 复,光复活酶 可见光(300-400nm)激活 分解胸腺嘧啶二聚体,光复活修复（photoreactivation repair）,2.3 切除修复（ excision repair）,2.2.1 碱基切除修复（ base-excision repair） 单个碱基缺陷：脱氨 胞嘧啶尿嘧啶 腺嘌呤次黄嘌呤 鸟嘌呤黄嘌呤 AP位点：无嘌呤 （apurinic） 无嘧啶 （apyrimidinic）,糖基化酶：切除错误碱基 AP核酸内切酶：切去脱氧核糖-5-磷酸 DNA聚合酶：填补 连接酶：连接 复制前修复,修 复,AP位点,2.2

12、.2 核苷酸切除修复（ nucleotide-excision repair）,一段DNA损伤：造成DNA螺旋结构较大的变形 修复： ABC切除核酸酶：从两侧切除损伤部位 DNA聚合酶：填补 连接酶：连接 复制前修复,ABC excinuclease,Uvr D helicase,2.4 重组修复（recommbination repair ）,DNA发动复制时尚未修复的损伤部位： 可以先复制再修复 缺口 修复： 从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。 复制后修复,2.5 易错修复 (error-prone repair),DNA链损伤严重

13、 应急反应（SOS ）求得生存,（三）修复系统中的遗传缺陷病,DNA修复缺陷引起的疾病： 着色性干皮病 (Xeroderma pigmentosum, XP) 遗传性视网膜母细胞（retinoblastoma） Fanconi贫血病（恶性肿瘤）,着色性干皮病（XP）：一种罕见的常染色体隐性遗传疾病，人缺乏修复系统对日光和紫外光敏感，易患一种皮肤癌，称为着色性干皮病。 XP患者对日光特别敏感，日光照射后，发生明显皮肤色斑、水肿，继之出现溃疡，甚至发生皮肤癌，有的并有神经症状。,名词解释,复制（replication） 半保留复制（semiconservative replication） 半不连续复制（semidiscontinuous replication） 先导链（1eading strand） 滞后链（1agging str