生化实验05凯氏定氮法-新版.ppt

1、1,实验06 植物组织中总氮含量的测定 （微量凯氏定氮法）,2,氮素代谢在植物新陈代谢中占有重要地位。测定氮素含量对于研究植物的营养生理，以及确定农产品品质、营养价值等均具有重要意义。 动植物组织中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮两大类，主要以有机氮形式存在。由于蛋白质的含氮量相对稳定，测定出样品中总氮含量，再乘上一个系数即可得出样品中粗蛋白含量。如要准确测定蛋白质含量，则需利用三氯乙酸将样品中蛋白质沉淀出来，再分别测定蛋白氮和非蛋白氮。 组织中含氮量常用凯氏定氮法测定。,3,一、原理,在催化剂（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的条件下，将植物材料与浓硫酸共热，有机物氧化分解成CO2和H2O，其

2、中的氮转变为氨，并进一步生成(NH4)2SO4，这个过程称为消化。在消化后的样品中加入过量的NaOH，经强碱碱化使之分解释放出NH3，通过蒸馏借蒸汽将NH3导入过量的硼酸溶液中生成四硼酸铵；再用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复到原来的H+浓度，根据盐酸的用量即可计算出样品中总氮的含量。,4,一、原理,以甘氨酸为例的化学反应式： 消化：CH2NH2COOH + 3H2SO42CO2 + 3SO2 + 4H2O+NH3 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 蒸馏: (NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O + Na2SO4 + 2NH3 2NH3 + 4H3BO3 (NH4)2B4O7

3、+ 5H2O 滴定：(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 2NH4Cl + 4H3BO3,5,材料：面粉仪器设备：消煮炉、海能K9840型自动凯氏定氮仪、Titrette滴定计、分析天平、消化管、蒸馏管、容量瓶、三角瓶、移液管等。试剂： 1. 浓硫酸（AR级）；2. 30-40%（W/V）NaOH； 3. 2%硼酸溶液； 4. 0.01mol/L HCl标准溶液； 5. 混合催化剂； 6. 混合指示剂； 7. 30%H2O2; 8. 标准(NH4)2SO4溶液,二、材料、仪器设备及试剂,6,简易凯氏定氮蒸馏装置,海能K9840型全自动凯氏定氮仪,7,三、实验步骤,1. 样品消化（已

4、完成） 准确称取0.1-0.2g样品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL浓硫酸和0.3-0.5g混合催化剂，浸泡数小时后在管口盖一小漏斗，放在消煮炉上加热消化。开始时温度可稍低，加热至管口不再产生泡沫时可逐渐升温，使消化管内液体达到微沸，直到消化液褐色消失并全部变为清澈透明为止。 在消化过程中，可分数次加入少许H2O2以加速有机物氧化。如发现在消化管上部有黑色颗粒，应小心转动消化管，用消化液将其冲洗下来。整个过程一般需3-4小时，均应在通风橱中进行。,8,2. 定容： 消化液冷却后，沿管壁仔细加入10 mL左右无氨蒸馏水以冲洗管壁冷却后转入100 mL容量瓶，再用少量无氨蒸馏水冲洗消化管数

5、次，洗涤液一并转入容量瓶冷却后用无氨蒸馏水定容至刻度，混匀后备用。,9,3. 蒸馏（1）使用前仪器检查：检查无氨蒸馏水（蓝色标签）、NaOH（30-40%、黄色标签）、H3BO3（2%、红色标签）三个试剂瓶是否装有规定的试剂、瓶盖是否盖紧（切忌漏气）；电源插头是否接通；冷却水源是否接牢。（2）加样：取10 mL样品消化液转入样品蒸馏管中，安装在定氮仪蒸馏管接口上（注意密接好）；安放承接蒸馏液的三角瓶（集液瓶）。,10,3. 蒸馏（3）开机：打开电源开关，仪器自动进入“自动、手动可选界面”。（4）参数设置：按“确认”键上、下箭头调光标于自动处，按下确认键，进入“当前参数”界面。参数值常规设置：稀

6、释水量5mL、硼酸体积10mL、加碱体积10mL、蒸馏时间4-5min（第1个样品5 min，以后样品4 min）、淋洗水量5mL。,11,3. 蒸馏（4）工作：仪器自动显示“集液瓶是否放置到位” 。确认放置到位后按确认键，仪器按设定的程序和参数值进行自动蒸馏，蒸馏中显示顺计时工作状态。蒸馏到预定时间，仪器停止工作且自动回复到“自动、手动”可选界面。取下样品管和蒸馏液瓶用于滴定。（5）再次蒸馏：装上下一个待测样品管和集液三角瓶，按确认键3次后，仪器开始自动再次蒸馏。,12,3. 蒸馏 （6）空白蒸馏 用未加植物样品的消化液（其余试剂都加入并按同样方法进行消化）为空白液，按样品消化液的蒸馏方法进

7、行蒸馏。注意事项：（1）参数修改：按“修改”键使用“确认”键周围的上、下、左、右箭头键选择修改指标输入设定指标值设定完毕按确认键； （2）从蒸馏仪上取样品管时，应戴上手套或用干抹布包裹操作，以防高温灼伤；（3）杜绝用化学污染的手在界面上操作；（4）当操作失误或出现异常情况时，按“急停”键停止工作；排除故障后，按“返回”键重新操作。,13,4. 样品及空白滴定 样品和空白蒸馏完毕后，分别用0.01 mol/L盐酸标准溶液滴定，直到硼酸-指示剂混合液变回淡紫红色即为滴定终点，记录滴定样品和空白蒸馏液的盐酸用量。（滴定空白蒸馏液的盐酸用量一般为0.2mL）,14,滴定计操作（1）打开电源开关，将滴定

8、阀旋至“循环”档；（2）逆时针旋转操作手轮，排出活塞管中空气，再顺时针旋转操作手轮至活塞和溶液上升到约一半位置；如此反复数次，直到汲筒管溶液中无大气泡；（3）旋下滴定管保护螺帽，将滴定阀旋至滴定档，逆时针转动操作手轮，排出滴定管中气泡；（4）按下清零按钮，逆时针缓慢转动操作手轮进行滴定。（5）滴定完成后，记录滴定体积。按下清零按钮，进行下一轮滴定。,数值清零按钮,液晶显示屏,计数暂停键,操作手轮,滴定阀,电源开关,保护螺帽,汲筒管,注意事项： （1）仪器昂贵，小心拿放；（2）滴定前确保接口密封；（3）各项操作不可用力过猛。,15,W= g（根据样品管编号在讲台上查表获得）； VT= mL; V

9、s= mL; A= mL；B= 0.2 mL,四、数据记录,五、结果计算,样品总氮含量（%）= 面粉粗蛋白含量（%）=样品含氮量（%）5.70,（C：滴定时标准盐酸溶液浓度（0.0100mol/L ）；VT：消化液定容总体积（mL）；W：样品质量（g）；Vs：蒸馏时取样体积（mL）；A：滴定样品所用盐酸体积（mL）；B：滴定空白所用盐酸体积（0.2 mL） ）,六、分析讨论,16,为了熟悉蒸馏和滴定的操作技术和检验实验的准确性及误差，常用已知浓度的标准硫酸铵溶液测试3次； 定氮仪的样品管连接处不能漏气； 取样品管时，小心避免强碱溅在身上引起灼伤或腐蚀衣物等； 使用完毕，切记关好电源和冷却水源。

10、,注意事项：,17,实验07 抗坏血酸（Vc）含量的测定 （滴定法）,18,一、原理,Vc具有很强的还原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有较强的氧化性，且在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。用草酸提取Vc，然后用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚溶液对其进行滴定时，Vc可将2,6-二氯酚靛酚还原成无色。但当Vc被消耗完后，再滴入少许2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈现红色，借此可指示滴定终点。根据标准2,6-二氯酚靛酚的用量，可以计算出被测样品中Vc的含量。,抗坏血酸又称为维生素c（Vc），在一般水果、果蔬中含量较高。测定Vc含量，可作为衡量果蔬品质指标之一。,19,材料：苞菜或其他果蔬仪器设备：

11、蒸发皿、天平、容量瓶、研钵、碱式滴定管、漏斗、移液管等试剂： 1. 2%草酸；2. 碱性2,6-二氯酚靛酚溶液（蓝色）； 3. 0.1mg/mL 标准Vc溶液（用草酸配制）,二、材料、仪器设备及试剂,2,6-二氯酚靛酚溶液（碱性、蓝色）,20,三、实验步骤,1. 样品提取 准确称取3g左右样品放入研钵中，加入2%草酸溶液约5 mL研磨匀浆液转入50 mL容量瓶，用草酸洗涤研钵3次，洗涤液一并转入容量瓶中用草酸定容至刻度过滤，收集滤液，备用。,2. 空白滴定 取2%草酸10 mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点，记录染料用量。,21,三、实验步骤,4. 样品滴定 取样品滤液10 mL至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为止。记录染料用量。,3. 染料标定 取10 mL标准Vc溶液至蒸发皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为滴定终点。计算1mL染料相当于Vc的mg数，即滴定度（A）。,22,W= g；V1= mL; V0= mL； VT= mL; Vs= mL,四、数据记录,五、结果计算,样品Vc含量（mg/100g）=,（ A：滴定度（