HGPRT---、TK---杂交瘤细胞Ig---、HGPRT.ppt

1、分子生物学实用技术,抗 体 技 术 李 官 成 中南大学肿瘤研究所 2012-5-7,免疫学的科学早期 (19世纪中叶-1912年),血清疗法： 1890年德国的贝林(Emil von Behring)和同事日本学者北里柴三郎(Kitasato)用白喉及其破伤风外毒素免疫动物，所获得动物血清可中各或破坏其毒素作用，并且可预防由毒素所导致疾病的发生。随后，被称之为“抗血清”。,贝林 E.,Behring 1854-1917 1901年获诺贝尔 生理学及医学奖,埃利希. P. (Paul Ehrlich, 1854-1915)德国细菌学家、免疫学家 1908年获诺贝尔生理学及医学奖,最早用化学反应

2、解释免疫过程。第一个定量地研究了毒素与抗毒素的沉淀反应，建立起抗体理论。由于他的研究，后来科学家才开始使用“免疫化学”这个名词，因此他被誉为免疫化学的先驱。,埃德尔曼.G.M. (Gerald Maurice Edelman, 1929-)美国生物化学家 1972年获诺贝尔生理学及医学奖,主要阐明了抗体分子结构，对生物化学和免疫学研究作出了重大贡献。 1969年4月，在美国实验生理学学会联合会第53次年会上，Edelman正式宣布：自己已解决抗体分子最详尽的化学结构即其氨基酸序列问题。与会者一致认为：这项研究成果“是解决抗体分子三维结构问题至关重要的一个步骤，是一项重大成就，它必将对进一步了解

3、抗体的功能发挥巨大的作用。,波特. R.R. (Rodney Robert Portel, 1917-1986)英国生物化学家 1972年获诺贝尔生理学及医学奖,首次提出抗体四肽链结构，为阐明 抗体的结构和它的特异性之间的贡 献，提供了极重要的证据。 是分子免疫学的创始人之一。 是Fc、Fab和重链与轻链的发现者。,因开发了放射免疫分析法，1977年获得诺贝尔生理学及医学奖。 发现在用胰岛素治疗糖尿病时，可使机体产生抗胰岛素的抗体。但是这一重要研究成果开始并未得到大家的承认，因为人们认为象胰岛素这样的小分子并不能刺激机体产生抗体。柏森（1972年逝世）和Yalow接着研究发现，向免疫复合物（由

4、标记的胰岛素及其相应抗体形成）中加入过量的未标记胰岛素时可使部分的胰岛素被取代。,雅洛. R. (Rosalyn Yalow, 1921-2011)美国物理学家 1977年获诺贝尔生理学及医学奖,研究病毒学和免疫学的专家 是世界上研究流行性感冒、白血病和病毒性疾病的权威。提出了间接模板学说和获得性免疫的无性繁殖系选择学说，对于临床医学、免疫学及分子遗传学具有极其重要的意义。 在免疫学理论上的建树是十分巨大的，他的理论假说对后继免疫学研究产生了深远而重大影响。在免疫学理论上，目前尚未见比他起到更大历史影响作用的研究者。,伯内特. F.M. (Frank Macfarlane Burnet, 18

5、99-1985)澳大利亚免疫学家 1960年获诺贝尔生理学及医学奖,他与与著名生物化学家米尔斯坦共同研究开发出一套制备单克隆抗体的新技术，被誉为上世纪70年代医学和生物学领域的一个革命。 他们1973年开始研究单克隆抗体。1975在英国剑桥医学研究会研究出一种新技术，可使鼠细胞与人类细胞融合，产生一种被称为“杂交瘤”的细胞。对这种杂交瘤细胞进行无性繁殖，即可产生大量抗感染的抗体。,科勒. G. (Georges Kohler, 1946-1996)德国免疫学家 1984年获诺贝尔生理学及医学奖,1975年他们将适应于组织培养的小鼠骨髓瘤细胞与免疫小鼠的脾细胞融合，获得了能分泌与免疫原起反应的抗

6、体的杂交瘤细胞株。这种杂交瘤细胞株既有骨髓瘤细胞的永生性（能在组织培养中大量增殖），又能分泌大量的单克隆抗体。,米尔斯坦. C. (Cesar Milstein, 1927-)生物化学家（英国和阿根廷双重国籍）1984年获诺贝尔生理学及医学奖,是现代免疫学之父，为现代免疫学的 建立奠定了基础。 提出了三个学说： 抗体形成的“天然”选择学说； 有关抗体多样性发生的学说； 免疫系统的网络学说。,杰尼. N.K. (Niels K. Jerne, 1911-)丹麦免疫学家 1984年获诺贝尔生理学及医学奖,一、抗体相关理论,抗体（antibody, Ab） 机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末

7、B细胞-浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,（一）抗体的发现,早在19世纪后期，Behring和Kitasato就发现用白喉或破伤风毒素免疫动物后产生一种可以中和毒素的物质，称之为抗毒素（antitoxin）。后引入“抗体”一词泛指抗毒素类物质。 1939年Tiselius和Kabati证实抗体为球蛋白。 1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会的专门委员会先后决定：将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。 免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig, SIg）膜型（membrane

8、 Ig, mIg）两种。Sig存在于备注及组织洲中，具有抗体的各种免疫功能；mIg是B细胞表面的抗原受休。,抗体生成理论 1897年 侧链学说 1930年 模板学说 1941年 间接模板学说 1955年 自然选择学说 1958年 克隆选择学说,（二）抗体的结构,(1) 重链（heavy chain，H） 2条 轻链（light chain，L） 2条 (2) 可变区（variable region, V区） 恒定区（constant region, C区） (3) 超变区（ hyper-variable region, HVR), 又称互补决定区(complementary determini

9、ng region, CDR） 骨架区（framework region, FR） (4) 铰链区（hinge region）,可变区恒定区（Variable and constant regions）,Hypervariable region, HVR (1, 2, 3) (高可变区) Framement region, FR (1,2,3,4) (骨架区) Complementarity determining region, CFR (1,2,3) (互补决定区) Antigen-binding site (抗原结合部位),（三）抗体的功能区,Ig的多肽链分子可折叠成几个由链内二硫键连接

10、的球形结构，每个球形结构由约110个氨基酸残基组成，并代表一个功能区。,（四）抗原抗体结合的基础,抗体对抗原的结合是一种典型的特异性免疫结合，抗体结合抗原的部位位于Fab片段可变区结构域中的CDR区。,（五）抗体基因的遗传控制,完整的抗体分子由轻链（包括和）基因和重链基因 编码。 编码一条免疫球蛋白多肽链的基因是由胚系中分隔开的 基因片段经重排而形成的。即免疫球蛋白的可变区和恒 定区是由分隔存在的基因所编码，在淋巴细胞的发育过 程中，这两个基因因为发生易位而重排在一起形成编码 完整免疫球蛋白分子的基因。,免疫球蛋白基因的染色体定位 人 鼠 重 链 14q32 12F1 kappa 链 2p12

11、 6c2 lambda链 22q11 16,重链可变区基因的重排,链基因的重排,链基因的重排,（六）抗体多样性机制,（1）编码Ig基因的多样性 （2）体细胞突变 （3）V、D、J基因连接的多样性 （4）H链和L链相互随机配对,二、抗体技术,抗体的产生有三种条途径： 经典途径：即免疫动物产生多克隆抗体（抗 血清）； 细胞工程途径：即运用杂交瘤技术产生单克 隆抗体； 利用基因工程途径表达和改造抗体。,抗体种类： 第一代抗体：多克隆抗体 polyclonal antibody 第二代抗体：单克隆抗体 monoclonal antibody 第三代抗体：基因工程抗体 genetic engineeri

12、ng antibody,（一）B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,克隆：细胞集落 单克隆：一个无性繁殖细胞集落 单克隆抗体：一个B细胞无性繁殖所产生的抗体 特点：一种抗体，性质、结构均一 杂交瘤：淋巴细胞+骨髓瘤细胞=融合=杂交瘤细胞 特点：继承淋巴细胞产生抗体 继承瘤细胞在体外长期培养,1.免疫原和免疫程序,(1)颗粒性抗原：细胞、微生物等 表面抗原一般有较高的免疫原性，不加佐剂。如细胞抗原一般以1-2 107 细胞腹腔注射。 (2)可溶性抗原：蛋白质类 一次剂量为10-100ug，需加佐剂。,(3) 弱抗原：多肽、糖类、类固醇等 与蛋白交联，如白蛋白、KLH等 (4) 微量抗原：常采用特殊

13、的免疫方法 体外免疫 10-100ng/ml 脾内一次注射 20ug(蛋白抗原)， 2.5 105 (细胞) 程序： 常规 0、21、42天免疫，52天试血， 融合前3天加强免疫 快速 0、14、28天免疫，38天试血， 融合前3天加强免疫,McAb and PcAb,McAb与PcAb的比较,2.培基的配制,基础培基：DMEM RPMI1640 选择性培基：HAT培基 谷氨酰胺、丙酮酸钠 血清：小牛血清（需筛选） 完全培基,3. 融合用细胞,（1）骨髓瘤细胞 不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK- 与提供淋巴细胞的动物品系相同 种类：小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 无Ig 缺乏HGPRT

14、NS-1 k 缺乏HGPRT 大鼠骨髓瘤细胞 Y3-Ag1.2.3 抗体得量较高 人骨髓瘤细胞 SK007 培养技术较困难,培养 选择对数生长期的细胞进行传代和融合 细胞106/ml 细胞老化 避免返祖：返祖即重新获得HGPRT 细胞用15-20ug/ml 8-氮鸟嘌呤处理 不要过多传代,（2）免疫脾细胞 目的 取得分裂活跃并能产生特异性抗体的B细胞，增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤频率。 来源 A. 小鼠脾脏：Balb/c 8-12周龄 B. 大鼠脾脏： C. 人：外周血淋巴细胞、淋巴结、扁桃体,（3）饲养细胞 定义 能够支持其它细胞生长的细胞。 来源 A. 小鼠的腹腔细胞 B. 大鼠的胸腺细

15、胞 作用 A. 产生非种属特异性生长因子 B. 吞噬坏死细胞,4. 细胞融合,(1)方法 A. PEG法 B. 自发触发 C. 仙台病毒 D. 受体指引法 E. 电融合法 F. 激光法 G. 磁场融合,(2)整个过程 A.饲养细胞的制备(融合前一天) 小鼠 消毒固定 暴露腹膜 注入Hanks 按摩 抽出 无血清培基洗一次 计数(2105 /ml) B.骨髓瘤细胞 复苏(前7天 ) 扩增 收集细胞(对数生长期) 计数及活力测定(活率 95%，总数 10 7 ),C.免疫脾细胞的制备 加强免疫后3-4天 免疫鼠 眼框放血 血清供检测用 处死消毒，无菌取出脾脏 制备单细胞悬液 50ml离心管静止5-

16、10分钟 吸上清于另一50ml离心管，1000rpm，10分钟 计数，活力测定。,D. PEG 作用机理：使细胞膜脂类分子在结构上发生重排， 细胞膜容易被打开，最终引起细胞融合。 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG， 其纯度与毒性有所不同 MW：600，1000，1500，4000，6000 MW 融合率 细胞毒性 配制：PEG，8磅15分钟；50 时加等量无血清培基(50%,W/V)。 30% 融合率低 50% 毒性,E.细胞融合 a.试剂、培基，37水浴。 b.脾细胞、骨髓瘤细胞混合，1-10：1。 c.1000rpm，10分钟。 d.轻弹离心管底部，使两种细胞充分混匀成

17、糊状。 e.加50%PEG 0.5ml (在37水浴中、边加边轻弹、1分钟内加完）。 f.静置90秒(37水浴)。 g.滴加15ml无血清DMEM(37预热)，2分钟内加完。 h.1000rpm，10分钟，弃上清。 i.加完全培基或HAT培基，调整细胞浓度5 105 /ml。 j.加入含饲养细胞的细胞板，每孔0.1ml。,5.选择性培养,(1)目的 脾细胞 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 (2) 原理 HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶,HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T

18、 (Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,核酸合成途径 HGPRT H 主要合成途径 糖、氨基酸 DNA A阻断 T TK,PEG 脾细胞 骨髓瘤细胞 Ig+、HGPRT+、TK+ Ig-、HGPRT-、TK+ 杂交瘤细胞 Ig+、HGPRT+、TK+ HAT 7天死亡 HAT 死亡 存活,(3)方法 A. 换液：2-3天换一次（半量换液） 7天内：HAT 7-14天：HT 14天后：完全培基 B. 观察,脾细胞 SP2/0 饲养细胞 杂交瘤细胞 0天 良好 良好 良好 可见融合细胞 1-2天 开始死亡 锐减 良好 成2-3个亮细胞 3-4天 大部死

19、亡 几乎完全死亡 良好 成簇3-5, 10个细胞 5-7天 死亡 死亡 变性 100 细胞成小岛 7-14天 1/3-1/5孔底,6.杂交瘤细胞的筛选,(1)选择筛选方法的原则 A. 快速简便 B. 敏感性高 C. 特异性好 D. 方法稳定 (2)步骤 A.筛出能分泌与预定抗原起反应的单抗 的杂交瘤细胞 B.筛出有预定特异性的杂交瘤细胞 C.筛出可供实际应用，具有稳定生长和 功能特性的均一后代的克隆,(3)方法 常用的方法：固相放射免疫测定 固相酶免疫测定 免疫荧光技术 间接血凝试验 微量细胞毒试验 斑点试验,ELISA,。,免疫荧光法,7.克隆化,(1)目的 选育出稳定而同源的细胞系，淘汰遗

20、传不稳定的杂交瘤细胞。 (2)方法 有限稀释法 显微操作法 软琼脂平板法 细胞选分仪法,有限稀释法,特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法 方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.51个细胞,FACS：效率最高价格昂贵,有限稀释法 (1)含饲养细胞的96孔细胞板。 (2)阳性克隆稀释成50、10、5细胞/ml。 例：假定细胞浓度为3.5 10 5细胞/ml 0.1ml+培基3.4ml 10 4细胞/ml A A0.1ml+培基9.9ml 10 2细胞/ml B B1.0ml+培基1.0ml 50细胞/ml C C1.0ml+培基9.0ml 10细胞/ml D D2.0m

21、l+培基2.0ml 5细胞/ml E,(3)每3-5天换培基一次。换培基前，先观察每孔中有无细胞“集落”？是一个还是多个？作出标记。 (4)7-9天后，细胞克隆长至孔底的1/3-1/2时，取上清进行筛选，检测有无特异性抗体存在。 (5)阳性孔转种24孔细胞板扩增，及时检测、做第二次有限稀释、冻存。,8.冻存和复苏,1.冻存 （1）目的：保证细胞不致因传代污染而丢失 避免多次传代发生变异丢失染色体 防止非分泌细胞的过度生长 防止细胞密度过高而死亡,（2）方法：液氮保存（-196 ） 配制方案：杂交瘤细胞（15）x106/ml) + 细胞冻存 液(30% 40% 牛血清，50%60% RPMI-

22、1640培养液，10%DMSO ) 分装 “慢冻”：分步冷冻，30-70液氮 2.复苏 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、 复苏,9.污染和控制,污染的微生物主要有： 细菌、酵母菌、霉菌、支原体等。 预防：(1)培基中加适当浓度的抗生素。 (2)器皿消毒彻底，无菌操作严格。 (3)环境减少空气对流。 处理：对重要的杂交瘤细胞污染后的挽救。,10.单抗的制备,(1)决定抗体产生的因素 Y=A C V 每个细胞的抗体产量A 一般：75-600个抗体分子/细胞/秒 鼠-鼠：50ug/ml 人-鼠：5-25ug/ml 人-人：0.25-10ug/ml 产生抗体的细胞浓度C 取决于总的

23、细胞浓度及分泌抗体细胞的%。,（2）体内产生单抗 A. 小鼠预处理： 石蜡油、降植烷等，腹腔注射。 B. 攻瘤： 预处理1周-2月内，用杂交瘤细胞攻击。 510 5 -10 6/ 只。 C. 采集腹水： 7-10天，小鼠腹部胀大，用注射器抽取腹水， 5-8ml/次，离心取上清，分装保存。,腹腔注射法,（3）体外产生单抗 A.含血清培养法 a. 静止培养法：10-50ug/ml b. 旋转培养法：100ug/ml c. 中空纤维：5mg/ml B.无血清培养法 优点：节约血清、不要纯化、减少过敏反应。 成分：基础培基（DMEM/RPMI1640） 血清替代因子（激素、生长因子，结 合蛋白，贴壁因

24、子，微量元素等）,(4) 新培养方法 A. 牛淋巴液体外循环培养法 B. 微囊培养法 C. DNA重组的细菌发酵法,11.单抗的特性和纯化,(1)理化性质 单抗IgG 多抗IgG 56 30min 完全失活 有活性 63 1hr内 10min内聚合 不被PEG沉淀 30min沉淀 pH pH6-8稳定 pH6-10稳定 pH8不稳定 IEF电泳分析 三条区带 20+条,(2) 优缺点 优点：（1）特异性高 （2）均一性 （3）可重复性 （4）永生性 （5）效价高 缺点：（1）太单一，对热、pH不稳定 （2）半衰期较短 （3）可能含有病毒,(3)纯化 单抗的纯花取决于实际应用的要求和单抗的类型。

25、 1.初步：硫酸铵沉淀法 2.IgG：正辛酸法、SPA亲和层析法、DEAE离子交换层析法等。 3.IgM：羟基磷灰石柱层析、SephadexG-200 、SephacrylS-300等。,盐析沉淀 亲和层析 离子交换层析,McAb的纯化,（二）基因工程抗体,基因工程（genetic engineering antibody）抗体兴起于80年代对鼠源性单克隆抗体（McAb）的人源化改造。 这一技术是将对Ig基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图采用基因工程方法，在基因水平对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体，也称为第三代抗体。,基

26、因工程抗体的优点,与单克隆抗体相比，基因工程抗体具有如下优点： 通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应。 基因工程抗体的分子量较小，可以部分降低抗体的鼠源性，更有利于穿透血管壁，进入病灶的核心部位。 根据治疗的需要，制备新型抗体。 可以采用原核细胞、真核细胞和植物等多种表达方式，大量表达抗体分子大大降低生产成本。,基因工程抗体制备的基本步骤 1. Ig可变区基因的克隆 2. 抗体基因的修饰及表达载体的构建 3. 抗体基因的表达与筛选鉴定,基因工程抗体分类,嵌合抗体 改型抗体 基本类型 小分子抗体 噬菌体抗体 催化抗体 抗原化抗体 双特异性抗体 抗体融合蛋白 胞内抗体,1、

27、嵌合抗体,方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力,基本原理 从杂交瘤细胞/淋巴细胞基因组中分离和鉴别出功能性的VL和VH基因，分别与人的轻、重链恒定区基因相连接，插入适当的载体中，构建成人鼠嵌合的重链和轻链基因，然后共转染骨髓瘤细胞，使之表达嵌合抗体。,优点 （1）用人源Fc段替代鼠源Fc 段，可在一定程度上减少体内治疗时所诱导的抗异种球蛋白反应。 （2）因为抗体重链C区所代表的免疫球蛋白同种型（包括类和亚类）的差异可影响抗体的体内功能，如产生

28、CDC、ADCC及免疫调理作用等，所以在构建嵌合抗体时，可有目的地改变抗体的类型或亚类，增加体内治疗的效果。,2、改型抗体,定义：指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇（CDR）序列改换成鼠源单抗CDR序列。重构成既具,有鼠源性单抗的特异性又获得人抗体亲和力的移植抗体（CDR-grafted antibody），也称为改形抗体或重构型抗体（reshaping antibody）。 意义：多种特异的鼠源单抗有可能应用于临床治疗,构建改形抗体的一般性原则,1. VH和VL的序列均应尽可能选自人的同一种Ig，以减少两条链装配的不亲和性。 2. 在选用人的Ig序列时，应选用其可变区氨基酸

29、序列与鼠源McAb可变区氨基酸序列同源性最大的Ig，以尽量减少McAb的CDR插入人的FR时影响CDR的构象。 3. 用计算机构建鼠源McAb的分子模型，可以发现FR中有一些氨基酸残基与CDR靠得很近，有可能影响CDR构象。还有一些FR的氨基酸残基直接与抗原接触。如果这氨基酸残基在人、鼠间不同，则一致改为鼠的残基。,4. 所选用的人Ig可变区中含有一些不常用的氨基酸残基，在改形抗体中则改为Ig通用的残基。 5. 有些FR序列在进化上具有高度保守性，人、鼠Ig之间轻链FR2、FR3、和FR4，重链的FR1、FR3、和FR4都有完全相同的序列。轻链FR1中有一种序列只有一个残基不同，重链FR3中有

30、一种序列只有两个残基不一致。利用这些序列不仅可能使抗原性降到最低限度，而且可能保持原抗体的亲和性。 6. 为提高抗体的亲和性，可以把CDR中与抗原表面最靠近的带静电的残基换成不带电的亲水残基，从而使抗体与抗原之间更紧密地结合。,3、小分子抗体,Fab 单链抗体 单域抗体 最小结合单位,（1）Fab 由重链VH加CH1及完整的轻链构成，大小为完整抗体的1/3。,木瓜蛋白酶水解,（2）单链抗体(scFv) 抗体可变区的重链和轻链（VH和VL）通过 连接肽（约15-25个氨基酸）连接而成的重 组蛋白，即VH-Linker-VL。它是抗体与抗 原结合的最小单位，其分子大小仅为完整 抗体的1/6。,完整

31、抗体,scFv,特点 具有与原亲本抗体相同的特异性； 分子量小，可迅速渗透至肿瘤内部或其他靶组织； 避免了Fc段引起的非特异性细胞毒性及免疫原性； 制备流程简单。,小分子抗体的主要应用领域 靶向载体 构建其它工程抗体 细胞内抗体(intrabody)：将小分子抗体基因导入细胞内，使其在细胞内特定部位表达，通过与靶抗原的结合影响其生物学活性。,4、双特异抗体 它有两个抗原结合部位可分别结合两种不同的抗原表位，其中一个臂可与靶细胞表面抗原结合，另一个臂则可与效应物（如药物、效应细胞等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞。,化学交联BsAb,分别分离纯化两种不同的McAb，使各抗体解离为单价抗体，

32、再使两种不同抗原特异性的单价抗体通过化学试剂交联起来，然后分离出目的组分。 此法缺点是容易导致抗体失去活性，产物均一性不佳。,细胞工程BsAb,将两种分泌不同特异性单抗的杂交瘤细胞进行再次融合，产生四源杂交瘤 (quadroma)。但二次杂交瘤细胞株分泌的是两套重链，轻链的随机组合物。BsAb在其中的比例可为10%50%不等。多倍杂交瘤细胞的稳定性差，BsAb的产量少且活性低，费时费力，临床应用时存在人抗鼠抗体免疫反应 (HAMA)，因此不适用于临床。,基因工程BsAb,多采用抗体分子片段,如Fab，Fv或 ScFv,经基因操作修饰后,或体外组装为BsAb,或直接表达分泌型的BsAb。,微型双

33、特异性抗体diabody 它是将同一抗体的VH和VL区分布在不同的肽链上，构成两种交联的ScFv，即 VLA-Linker-VHB和VLB-Linker-VHA。每条独立的ScFv链均不具备结合抗原的活性，而它们从大肠杆菌共分泌后形成的异二聚体，则可同时识别并结合两种特异性抗原。由于它具有这种双特异性，因此在应用上有更大的优越性。,5、抗体融合蛋白 一类是将Fv段与其他生物活性蛋白如毒素、酶等结合，利用抗体的特异性识别功能将某些生物活性物质引导到特定部位。 另一类是含Fc段的抗体融合蛋白，它是利用Fc段所特有的生物学功能与某些有黏附或结合功能的蛋白融合而成。,6、噬菌体抗体 利用基因工程的方法

34、将全套人抗体重链和轻链V区基因克隆出来，通过噬菌体表面呈现技术，将抗体分子Fab段或scFv段表达在噬菌体膜表面，经筛选后获得特异性抗体，即噬菌体抗体。这种技术称为噬菌体抗体库(phage antibody library)技术。所构建的抗体库称为全套抗体库(repertoire antibody)或组合抗体库(combinatorial antibody library)。,基本原理 该技术以噬菌体为载体，将抗体基因(Fab或scFv基因等)与噬菌体编码的外壳蛋白(CP)或（CP）相连，在噬菌体表面以抗体外壳蛋白融合蛋白的形式表达，经辅助病毒感染后，借助CP的信号肽穿膜作用，进入宿主外周基质

35、，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随着携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体的噬菌体。这种噬菌体抗体可以特异识别抗原，又能感染宿主进行再扩增。因此可以采用类似于亲和层析原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。,构建噬菌体抗体库,从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B淋巴细胞，提取mRNA并逆转录为cDNA； 应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的Ig基因片段； 构建噬菌体载体。噬菌体抗体库载体有噬菌体、丝状噬菌体和噬菌粒三种，其中后二者是目前构建表面表达的噬菌体抗体库(surface display antibody library)常用载体； 表达载体转化细菌，构建全套抗

36、体库。通过多轮的抗原亲合吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。,基本原理 :,主要特点： 基因型和表型相统一 选择能力和再扩增能力相结合,优点 1.模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 方法简单易行，节省时间。可通过发酵生产、大量制备。 2.避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 3. 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体,四、抗体的应用,（一）研究工具,1.探针 单抗只与抗原分子上某一个决定簇相结合，作为探针可从分子、细