靶向PCR CTC检测技术PPT参考课件

1、靶向PCR CTC检测技术 帮助临床医生更全面地评估肺癌,1,2020/8/31,Lung Cancer in Solid Tumor in China,2,2020/8/31,=,？,液态活检 通过外周血中的肿瘤细胞或者肿瘤基因组信息来评估肿瘤,病理活检 通过原发灶肿瘤组织来评估肿瘤,CTC ctDNA mircoRNA LNC RNA Others,传统的组织细胞学检测,液态活检在肺癌中的应用,治疗策略,事件,疑似肺癌,辅助诊断,早癌肺癌,晚期肺癌,癌症耐药,复发监测,治疗方案选择,耐药机理 新药研发,CTC的临床应用价值,疗效评估,CTC(数量） (负向富集+靶向PCR）,ctDNA (

2、基因变异）,5,2020/8/31,1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,肿瘤释放如外周血中CTCs数量的多少，可间接反应肿瘤发生发展的功能状态,CTC：在肿瘤发生过程中，具有干细胞特征的肿瘤细胞和不具有干细胞特征的肿瘤细胞，均由原发肿瘤脱落释放入外周血，两者统称循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有转移：侵入第二器官CTCs，称之为DTC

3、（disseminated Tumor Cell），只有由具有干细胞特征的DTC所形成的微转移灶，逃避免疫识别才可能发展成为肿瘤远处转移2,什么时候可以检测到CTC？,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期肿瘤外周血中即可检出CTC,表达中等量FR的M109鼠肺癌细胞通过皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部侧面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分钟可以检测到大约1.4个CTC细胞 移植后第3和第4周，则每分钟可分别检测7个和18个CTC，随着肿瘤逐渐增大数量呈指数上升 在肿瘤移植的前4周内，没有在任何组织切片中发

4、现到存在转移性癌症的迹象,CTC富集技术 密度与大小 免疫磁珠（负向富集 or 阳性富集) 微流体,CTC检测方法,CTC检测技术 靶向PCR 免疫荧光 普通PCR,=,+,“方法”,“收获”,“垃圾”,蟹饵,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没贪嘴， 我们逃了,10,2020/8/31,“方法”,“收获”,“垃圾”,没水了， 我们躲不了了,放 水,负向富集,优势：回收率100% 劣势：纯度略低,幸好没吃胖， 我们逃了,网 筛,11,2020/8/31,CTC检测技术 检测原理,负向富集,靶向PCR,FR阳性靶标,肺癌细胞FR(叶酸受体）高度表

5、达 CTC：FR=1:50万 EMT转化不影响FR丰度 其他血细胞不表达FR,CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自动化,灵敏度超高，负向富集可满足检测要求 信号二次放大，1个CTC信号放大1012倍 无需人工经验判读，结果客观准确 可实现CTC的定量,12,2020/8/31,CTC检测靶向PCR，信号放大，保证高度敏感性,1个CTC信号放大1012倍,13,2020/8/31,CTC检测,优势一：阴性富集不丢失循环肿瘤细胞,优势二：靶向探针特异性高,优势三：PCR扩增信号，确保高敏感性,优势四：PCR仪判断CTC技术，避免人为误差,14,2020/8/31,3mL血,1mL/3mL血

6、,3mL血,1个CTC/3mL血,50万FR/1个CTC,1个CTC/1slide,100万信号/1个FR,1个信号/1个CTC,FR靶向PCR 1个CTC细胞信号方法1012倍（万亿倍）,细胞免疫荧光 1个CTC细胞信号几乎没有放大,15,2020/8/31,Cell Search:正向富集+免疫荧光技术进行捕获和鉴定,16,EpCAM 上皮细胞粘附分子 APC 异藻蓝蛋白荧光染料 CK 细胞角蛋白 PE 藻红蛋白荧光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）,2020/8/31,EpCAM阴性细胞中，存在大量CTC,Cell Research系统主要使用EpCAM（上皮

7、粘附分子）做为探针 研究证实，EpCAM阴性的细胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,17,2020/8/31,2004,Cell Search: 乳腺癌中检测出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗体(EpCAM)对EMT细胞特异性差，而肺癌细胞转移入血需要EMT的过程,19,2020/8/31,3mL血6个小时得到报告,检测流程,20,2020/8/31,肺癌领域，CTC检测技术对比,不同CTC计数对于肺癌诊断的特异性与敏感性,22,2020/8/31,CTC对肺癌的诊断显著优于一般肿瘤标志物,CTC与一般肿瘤标志物

8、对肺癌诊断的准确性（AUC值）,23,2020/8/31,单项CTC检测的辅助诊断价值优于多个一般肿瘤标志物联合,AUC=0.91, P0.0001,AUC=0.76,24,2020/8/31,不同病理类型中，CTC辅助诊断价值均优于一般肿瘤标志物,25,2020/8/31,CTC肺癌辅助诊断小结,CTC反应肺癌发生发展功能状态，肺癌辅助诊断价值显著优于一般肿瘤标志物 靶向PCR CTC技术：所有肺癌敏感性提高3倍，I期肺癌提高10倍,26,2020/8/31,CTC：用于化疗疗效评估，先于肿瘤大小发生变化，评估肿瘤功能状态,NSCLC, 1st-line carboplatin, pacli

9、taxel (d); NSCLC, 2nd-line pemetrexed(e) Baseline CT scans were before therapy initiation and CTC measurements began at or shortly after the first treatment.,27,2020/8/31,CTC数量变化与RECIST标准基本一致,28,2020/8/31,FR靶向PCR CTC检测与肺腺癌患者一线培美曲塞化疗疗效相关,培美曲塞是一种抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长 FR靶向PCR CTC检测

10、技术特异性检测循环肿瘤细胞表面叶酸受体含量 研究数据发现，接受一线培美曲塞化疗的肺腺癌患者治疗前CTC水平越高，ORR与PFS越好 叶酸受体表达量与培美曲塞治疗效果正相关,29,2020/8/31,Cut off为16cu/3ml, 高表达患者的ORR明显优于低表达者,CTC16: 8/12（75%）患者PR，DCR 100% 8.7CTC16: 1/9（11%）患者PR,30,2020/8/31,CTC16: PFS 448天 8.7CTC16: PFS 94天,Cut off为16cu/3ml, 高表达患者的PFS明显优于低表达者,31,2020/8/31,总结,靶向PCR CTC检测技术敏感度最高，反应肿瘤发生发展的功能状态，可做为新