哺乳动物DNA的快速分离与PCR扩增.ppt

1、,实验二、 哺乳动物组织DNA 的快速分离与基因的PCR扩增 主讲教师：周建林、刘如石、韩梅,一、 实验目的 1、了解真核细胞中基因组结构与组成的复杂性；学会 并掌握从哺乳动物组织中提取基因组总DNA的原理 与技术，为PCR分析，RFLP分析，基因文库的构 建，基因探测等的研究打下基础； 2、学习与掌握PCR扩增基因的原理和操作方法，了解 PCR基因扩增技术在分子克隆，目的基础检测，遗 传病的基因诊断，法医学，考古学等方面的应用。,二、实验原理,1、哺乳动物组织DNA的提取：在EDTA（鳌合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下，用蛋白酶K消化真核细胞或组织，用去垢剂如SDS溶解细胞膜并使蛋

2、白质变性。核酸通过有机溶剂进行抽提纯化。污染的RNA通过RNase消化去除。根据本方法制备的哺乳动物DNA约2050 kb，适于作PCR反应的模板。DNA产量在0.53.0g/mg组织之间。 2、多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称技术：技术实际上是在模板， 引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。 反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（ex tension），反应过程见图。,模板DNA在94条件下变性形成单链； 在55条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别

3、与其同源序列结合；70下在耐热性DNA聚合酶Taq 酶催化下， 在种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的DNA为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标DNA都以n次幂扩增，30次循环后目的DNA的量增加1067倍。成功的PCR反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。 要达此目的PCR反应要注意以下问题： 、 DNA模板：反应中DNA量在50ng200ng左右。且DNA纯度 较高，以增加反应特异性。 、dNTP:反应体系中达100M200M。,、Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq 酶活力降低；太高反应特异性降低

4、； 、引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左 右，含量在40 70之间，引物内部不能有回文 序列，引物端不能互补； 、Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性聚合酶， 在95时30 min还有50活力； 、变性温度：在9395之间使模板充分变性。 、复性温度：55左右，此温度选择是根据模板和引物配 对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。 、延伸温度：7072左右，为Taq酶最适反应温度。,三、实验仪器、材料与试剂 1、实验仪器与材料： 台式高速冷冻离心机，恒温水浴，真空泵，PCR仪，台式冷冻离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统，凝胶成像系统，冰箱、微量移液器、组织匀浆及，制

5、冰机，一次性使用塑料手套和乳胶手套，猪肝组织。 2、实验试剂： 细胞裂解缓冲液：10 mM Tris-Cl (pH 8.0),1 mM EDTA (pH 8.0), 0.1% SDS，70% 乙醇，异丙醇，醋酸钾(pH=4.8) ( 60ml的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5 ml H2O)，TE (pH 8.0)或无菌水，无DNase的RNase A (10mg/ml)，蛋白酶K(20 mg/ml)； TaKaRa Taq (5U/ l)，10PCR Buffer (Mg2+ Plus)，dNTP Mixture (each 2.5 mM)，猪肝基因组DNA，引物（Fo

6、rward primer and Reverse primer)。,四、实验操作步骤 （一）、猪肝组织DNA的抽提 1、切下10-20 mg 组织，在液氮中碾磨成粉末。 2、将粉末转入1.5 ml 离心管中，加0.6 ml 细胞裂解 缓冲液和3 l 蛋白酶K，混匀，置于55 水浴中3 h 以上,但不要超过16 h。 3、消化液降至室温，然后加入 2 l无DNase的RNase A，混匀。37 水浴中放置0.5 h。 4、将样品降至室温，加入 200l 醋酸钾溶液，剧烈震荡20 s使其充分混合。冰上放置5 分钟。 5、12000 rpm 离心 5分钟 （4 ）。,6、将上清液转移到一个新离心管中

7、，加0.6 ml 异丙醇。 充分混匀， 12000 rpm 离心 5分钟 （4 ）。 7、去掉上清，加入0.6 ml 70% 乙醇。颠倒离心管数次， 12000 rpm 离心 1分钟（4）。 8、去掉上清，空气中干燥 DNA沉淀 15分钟。 9、将DNA沉淀溶解于 100 l TE 或水中。 10、浓度和纯度测定： OD260/OD280= 1.8-2.0； 1 OD260= 50 g/ ml （二）、PCR扩增基因片断：,1、设计PCR反应程序 94预变性2 min后开始以下循环 94 30 sec 49 30 sec 20 cycles 72 30 sec 72 5 min； 4 冷却恒定

8、。,2、在0.5ml薄壁管中，依次加入以下各成分： ddH2O: 19.9 l 10buffer: 2.5 l dNTPs(2.5 mM) 0.5 l Forward primer (10M) : 0.5 l Reverse primer (10M) : 0.5 l Taq DNA 酶(5U/l) : 0.1 l Template DNA(20ng/ l): 1.0 l 总体积 25 l,3、混匀后，离心2-3秒，将PCR薄壁管放入PCR仪的 样品槽中，选择预先设定的程序，按START键启动 PCR仪。 4、采用1.2琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引 物扩增的特异性。 五、实验结果与分析 1、提取的猪肝DNA进行电泳后，采用凝胶成像系统 进行拍照并对电泳图谱进行适当的分析； 2、对PCR扩增的基