第一章生物材料检验绪论.ppt

1、生物材料检验 physical and chemical analysis of biomaterial,一、生物样品的收集、保存和预处理,1.生物样品的收集、保存 尿样 血样 头发、指甲 组织、脏器 呼出气 2.生物样品的预处理 无机物消化 有机物分离,二、常用仪器分析方法 1.光化学 紫外可见 原子吸收 荧光 2.电化学 电位 极谱 伏安 3.色谱 LC GC HPLC,三、生物材料检验的内容,一、金属元素的测定 （ Determination of metal elements in biomaterials ）： 铜 、 铁 、 锌 、钙、镁 、锰 、铝 、铅 、镉 、汞 、钒 、铬

2、、镍 、铊 二、非金属化合物及其代谢产物的测定 （Determination of nonmetallic compounds and their metabolites ） 一氧化碳 、二硫化碳 、硒 、碘 、砷 、氟 、氰化物,三、芳香烃及其代谢产物的测定 （Determination of aromatic hydrocarbon and their metabolites ） 苯 、甲苯和二甲苯 、乙苯 、苯乙烯 、苯并a芘 四、卤代烃化合物及其代谢产物的测定 （ Determination of alkyl halides and their metabolites ） 氯乙烯 、三

3、氯乙烯和四氯乙烯 、氯苯 、,五、农药及其代谢产物的测定 （Determination of pesticides and their metabolites ） 有机磷农药 、有机氯农药 、拟除虫菊酯类杀虫剂 、杀虫脒 六、其他有机毒物及其代谢产物的测定 （ Determination of other organic toxin and their metabolites ） 五氯酚 、甲醇 、丙酮 、正己烷,第一章 绪论 Chapter 1 Introduction,第一节 概述 Section 1 Outline,一、基本概念 1.生物材料（biological material）:

4、人体体液（如血液）、排泄物（如呼出气、尿液）、毛发、指甲以及组织脏器等的总称。 2.生物材料检验（analysis of biological material）: 主要内容：生物材料中化学物质及其代谢产物或由化学物质引起机体产生的生物学效应指标变化的检验方法。,3.生物监测（biological monitoring）: 系统收集人体生物材料样品，定期检测其中毒物或其代谢产物的含量，或由它们所引起的效应水平，以评价人体接触化学物质的程度及对健康的影响。 生物材料检验是生物监测的重要组成部分，生物监测需要通过生物材料检验来实现。 生物监测通过对不同生物材料中有毒物质的检验，不仅能比较准确地反映

5、从各种途径摄入体内的化学物质的内剂量，而且能更科学地评价外源性化学物质的健康危险性。 生物监测结果受个体差异等因素的影响大，有些指标的参考值随地区和测定方法而异，取样时间、运输和保存条件等因素均可影响测定结果。,4.生物标志物（biomaker）： 生物标志物指生物系统接触外源性物质后出现的一种改变，主要是化学物质在生物体内形成的代谢产物，以及可测定的生理、生化、免疫、细胞或分子的变化，主要用于接触评价、健康危害评价以及临床诊断等。 根据其性质，生物标志物可为三类： 接触性生物标志物（biomarker of exposure ）：即生物体内可分析测定的有害物质、代谢产物以及它们同生物体内分子

6、或细胞相互作用所形成的中间物等。 效应性生物标志物（biomarker of effect）：那些同健康危害或疾病有关的可测定性的生理、生化、行为以及其它生物学变化。 敏感性生物标志物（biomarker of susceptibility）：指生物体先天固有或后天获得的对外界有害因素所引起的有害效应的反应能力。,5.生物接触限值（biological exposure limit，BEL）和正常参考值（normal reference range） 在评价有害因素对人体健康的影响或人体是否缺乏某种元素时，可分别用生物接触限值和正常参考值作为评价依据。 （1）生物接触限值：为保护作业人员健康，

7、对生物材料中有害物质或其代谢产物所规定的最高容许浓度，或某些效应指标改变所容许的浓度范围。 相当于健康工人吸入或接触工作环境空气最高容许浓度的毒物时，生物材料中被测物的含量水平。 美国为生物接触指数(Biological Exposure Index，BEI) 德国为生物学耐受量(Biologische Arbeitsstofftoff Toleranzwerte，BAT)。,（2）正常参考值： 指无明显肝、肾及血液系统疾病和无职业有害因素接触史的“健康正常人”的生物材料样品中某种成分的含量或生化指标值。 常通过对某地区的“健康正常人”抽样检测所得结果进行统计分析而确定。,二、生物材料检验的目

8、的 1.反映毒物进入机体所造成的危害程度，以了解机体接触毒物的 情况，为中毒诊断和疗效观察提供重要参考指标。 2.有时为了观察机体正常组分的含量水平，为确定正常值范围，地方病防治诊断或检查青少年生长发育状况提供依据。,三、毒物的分布、排出途径 毒物经呼吸道、消化道、皮肤等途径进入人体后随血液循环分布于全身 有些毒物可蓄积于某些组织和器官 大部分通过肾脏、肠道、毛发、 汗液、唾液、肺泡和乳汁等途径排出。,四、 供检验的生物材料 尿液、血液、呼出气、胃液、胆汁、汗液、唾液、乳汁、 粪便 、毛发、 指甲、骨以及动物的脏器组织等。,五、生物材料检验的项目 1.种类 （1）化学物质原形 （2）化学物质的

9、代谢产物 （3）毒物所致的生物效应指标 2.要求 （1）特异性好 （2）有剂量-效应关系 （3）有一定灵敏度及准确度的测定方法 （4）稳定性好 （5）便于取材，不造成受检者伤害,第二节 生物样品的收集与保存 Section 2 Collection and preservation for biomaterials,一、尿样的收集与保存 （一）为什么收集尿样 进入机体的极大多数毒物及其代谢产物均可从肾脏排出（苯苯酚，氯乙烯硫代二乙酸，汞，铅，氟 多数毒物在尿中的含量及其在血中的浓度有较大相关 收集方便,（ 二）尿样的收集方式 1. 24小时尿：由于某些毒物从体内排出无规律，一昼夜间尿中 含量波

10、动较大。需取24小时尿混合后，取适量进行分 析，称为24小时尿或全日尿。 优点：不受某些毒物排出无规律的影响。 缺点：时间长，麻烦，夏天因保存时间过长容易腐败变质。,2.定时尿 对某些毒物排泄速度较快，当停止接触毒物后尿中被测物含量明显降低者，采用上班前，上班时和下班后（接触前，接触时和接触后）分别留尿样方法。了解机体接触该毒物的情况。,3.晨尿 优点：收集晨尿比较方便，对多数测定均能反映实际情况。,标准比重校正法：可采用将尿样达到标准比重（我国1.020）然后计算其浓度的方法。这样可减少由于饮水量和排汗量的影响，明显缩小各次采样之间的误差，使一次尿样和24小时尿样接近 C 校 ： 校正后尿中

11、某成分浓度（mg/L） C 测 ： 未校正时尿中某成分浓度（ mg/L ） d ：尿样实测比重 K ： 可查表，校正尿比重到1.020的系数, 肌酐校正法 健康人一日排尿所含肌酐量为1.8克左右，故建议以1.8克肌酐所相当的被测成分的毫克数来代表全日尿中某成分的含量。 尿中待测成分的含量（mg/g肌酐）乘以1.8，即可换算成24h尿中的含量（mg/24h）。,（三）收集尿样的容器和保存条件 1. 晨尿、随机尿通常收集于500 ml清洁的硬质玻璃瓶或聚乙烯塑料瓶中。若盛放测无机离子的容器，需事先用稀硝酸浸泡，然后用水冲洗干净。晾干备用。 2. 24小时尿样一般收集于2L硬质玻璃瓶中，由于收集时间

12、较长，可考虑加入少量防腐剂（如氯仿）并注意贮于阴凉处。 3. 如不及时测定，需冷藏或冷冻保存。,二、血样的收集与保存 （一）为什么要取血样 1. 血液中有毒物质的浓度，可反映机体近期接触该毒物的程度，常与体内吸收的毒物量呈正相关。 2. 血样具有含量较稳定，波动小，取样污染机会少，以及不受肾功能影响等优点,（二）收集方法 1. 收集微量血液，可自耳垂或指头取。 2. 收集0.5ml以上的血液，可自肘部抽取静脉血 3. 取血时间最好在早餐前。 4. 如检验需用全血时，可将血液收集于盛有少量抗凝剂的容器内，抗凝剂如肝素、草酸钠、氟化物,（三）注意事项 1.采血过程避免污染，防止采用不干净的采样器具

13、。皮肤消毒不良。血中加入含杂质的抗凝剂以及使用不适当的容器存放血样。（采样器具、消毒、抗凝剂、盛放器具） 2. 容器：要求使用不带颜色的器皿，一般依下次序选择：聚四氟乙烯、 聚乙烯 、石英、白金、硅硼玻璃。 3.分析血中的金属物质，容器应不含金属，一般应先用洗涤剂洗净 ，再用稀硝酸或稀盐酸浸泡，然后用去离子水反复冲洗，晾干备用。,三、头发和指甲的收集与保存 （一）为什么对头发和指甲收集保存 1.有些毒物如As、Cd 、Cr 、Hg、 Pb等可较长时间蓄积于头发和指甲内，因此在脱离接触后，毒物在尿液、血液中含量已明显降低，而在头发指甲中含量仍然较高，故检验毒物在头发和指甲中的含量具有一定的价值。

14、 2.由于头发和指甲的收集、保存、携带都较方便。,（二）取样方法： 头发的各部位蓄积的毒物含量不同，有时需要分段测量。通常采集枕部距头皮2.5cm 以内的头发，经洗净干燥，混匀后作为分析样品。,（三）注意事项 头发和指甲表面易受污染，测定时必须洗涤干净。既要洗涤干净外源性污染物，又不能让 内源性成分溶出。,四、组织和脏器的收集与保存 （一）为什么收集组织和脏器样品 1.在毒物的毒性实验和毒理学研究方面，常用动物的组织脏器作为 检验样品，以探讨毒物在机体内的分布和蓄积情况。 2.在法医学方面，对于偶然中毒事故而死亡者进行尸检时，亦有采用。,（二）收集原则 1.样品收集后应尽快进行检验，以避免挥发

15、、氧化、分解、变质，影响检验结果。 2. 如不能及时送检，应将样品放在阴凉处或暂放冰箱内。 3. 一定要避免污染。,五、呼出气的收集和保存 （一）为什么收集呼出气 1.一些有机物进入机体后，可以经呼出气排出。 2.采集呼出气操作简单、无损伤性，呼出气中干扰物少，有利于测定。,（二）取样方法 常用的采样器： 铝塑复合膜采气袋 两端有三通活塞的玻璃管,图41 呼气样品的采集 1.呼吸面罩 2.阀门系统 a吸气、b呼气 3.装有纯净空气的Tedlar袋 4.装有Mg(ClO4)2的干燥管 5.三通阀 6.装样品的Tedlar袋,（三）注意事项 1.采集班前呼出气时，必须在空气清洁的场所进行。 2.采

16、气袋和采气管应有好的密封性。 3.采集的呼出气应尽快检验，一般不能长时间保存。 4.肺功能不正常者一般不应采集呼出气作为生物监测样品。,六、 取样分析原则 1.血液、尿液及其他体液必须充分混匀后再取样分析。 2.骨和脏器样品应剔除脂肪、结缔组织等异体物质后，彻底粉碎、充分混匀后才可称取分析样品。 3.贮存于低温冷冻的样品，如血、尿、骨及其他脏器组织应先自然解冻，放至室温后，重新混匀取样。 4.烘干、粉碎、磨细或剪碎的发、骨及其他脏器组织的干样，称样前必须干燥至恒重。 5. 称取样品的量应保证样品的代表性，其中待测物质的浓度或量必须满足分析方法的定量下限。,第三节 生物材料样品的预处理 Sect

17、ion 3 Pretreatment of biomaterial sample,一、无机元素分析的样品预处理,基本要求： 避免待测元素损失及污染； 尽可能减少化学试剂的用量； 操作简便，省时； 待测组分回收率达到分析要求； 操作过程安全性高。,（一）稀释法,1.液体 血清、组织液等本身为液体的样品，如测定其中的金属元素含量，可用水、稀酸溶液、含表面活性剂（如Triton X-100）或有机溶剂（如正丁醇、乙酸乙酯）的水溶液简单稀释后测定。 如：血清样品可用6%正丁醇水溶液或1%硝酸水溶液稀释10倍后用火焰原子吸收法测定其中铜、铁、锌等； 全血可用0.01%Triton X-100水溶液稀释后

18、测定。若基体效应对测定影响大，也可用基体改进剂溶液稀释后测定。 2.固体 毛发、软组织、指甲、骨、牙等固体样品也可用适宜的溶液溶解后测定。 如：用25%四甲基氢氧化铵的乙醇溶液溶解骨、指甲、毛发、软组织等，用原子吸收法测定其中铜、锰、锌、铅、镉等金属的含量。,(二)酸提取法,1.方法 用酸溶液直接从样品中提取待测成分，不需完全分解破坏有机物，只需将待测成分定量转移到溶液中。 2.特点 （1）所用试剂量比较少，处理过程简单，处理条件温和。 （2）空白值低，且造成待测成分损失或污染的可能性小。 （3）需注意基体干扰和提取效率是否能达到分析要求。 例如 用1mol/L HCl浸提粪便中的锌； 用2m

19、ol/L HCl 于60水浴加热1h定量提取血浆中的锰； 1%的硝酸可定量提取标准物质牛肝中的镉、铜、锌、锰； 用三氯乙酸从血清蛋白中提取铁。,（三）矿物化法,1.干灰化 在供给能量的前提下直接利用氧来氧化分解样品中有机物的方法。 高温炉干灰化法一般操作步骤分为干燥、炭化、灰化和溶解灰分几个过程。 待灰化样品必须干燥，否则在高温下发生暴溅，使样品丢失或玷污。 另外，需注意某些元素的气化损失。,2.湿消化法 利用氧化性酸和氧化剂对有机物进行氧化，以分解破坏有机物。 最常用的氧化性酸和氧化剂有H2SO4、HNO3、HClO4和H2O2。 湿消化法也有待测元素挥发损失的问题。如Hg、Se在还原条件下

20、或出现炭化时，被还原而挥发损失，应予以注意。,（四）加压分解法,1.加压分解法 将样品置于密闭容器中的一种湿消化法，其利用压力以提高酸的沸点以加速样品中有机物的破坏。 加压分解多在内衬聚四氟乙烯容器的压力罐中进行，外面有一个加热用的壳，多用不锈钢制成，内部为聚四氟乙烯制成的容器，有的带有罗纹帽，聚四氟乙烯容器可取出，以方便倒出消化液。 2.优点：与常压下的湿消化相比 （1）提高了酸的利用率； （2）有效防止了易挥发性元素的挥发损失； （3）减小了空白值和降低了污染的可能性； （4）处理温度比较低，一般不超过150，节约能源。 3.缺点：样品处理量较小，通常少于0.5g。,（五）微波消解法,1.

21、微波消解 利用微波作为加热源进行消解，微波消解法仍属湿消化法。 1975年，国外即有人利用微波炉对生物试样进行消解。至今，微波消解已广泛应用于无机分析领域。 2.微波 是指频率在300300,000MHz的电磁波。在传送中微波遇到金属等导体会发生反射作用，遇到绝缘体则主要发生穿透作用，而介电物质则位于两者之间，对微波具有吸收、穿透和反射作用。,3.原理 试样、溶剂（水、酸等）或脂肪是吸收微波的介质。微波穿透容器直接辐射到试样和溶剂中，使分子极化，高频辐射又使极化分子快速转动，产生猛烈的摩擦、碰撞、振动和撕裂，使温度急骤上升，使试样与试剂的接触界面不断快速更新，粒子间发生局部的内加热，引起酸与试

22、样间热对流、搅动并消除已溶解的不活泼试样表层，促进酸与试样更有效地接触，因而加速了试样的分解。 4.特点 处理样品速度快 试剂消耗量小 空白值低 对环境污染小 节约能源 易于自动化 样品制备精密度高,（六）酶分解法,1.酶分解法 利用酶分解蛋白质而进行样品处理的方法称为酶分解法，这类方法特别适于生物样品。 2.优点 （1）作用条件温和，能有效防止待测物的挥发损失； （2）可维持金属离子原有价态，因而可进行形态分析； （3）既可用于无机成分分析，也可用于有机成分分析。 例如，将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的混合溶液与肉作用，于pH7.8和37下水解蛋白质，可测定样品中的Cr(III)和C

23、r(VI)。 枯草杆菌蛋白酶等还可从蛋白质中释放出与蛋白质结合的化合物，如从猪肾中释放出黄曲霉毒素。,二、有机物分析样品的预处理,对生物材料中有机毒物及其代谢产物进行分析时，可能需要对样品进行提取、富集、净化，甚至衍生化。 样品的提取和富集技术近年来发展迅速。 很多快速、有效的新技术被应用于生物材料样品有机毒物分析的前处理中： 经典：溶剂萃取 新技术：固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取和基于大分子物质间特异性亲和反应的亲和萃取等新技术得到了广泛的应用。,（一）顶空法,1.顶空法 适宜于易挥发有机化合物的测定。 （1）静态顶空法 如测定尿中甲醇时，可取一个1030m1带密封盖的小瓶或容器(顶空

24、瓶)，将尿样置于瓶中，立即盖严，将容器置一定温度水浴保温一定时间，使液相中的甲醇挥发至液面之上的空气中，达到气液平衡后，用注射器抽取顶空瓶液面上部空气直接注入气相色谱仪分析。 （2）动态顶空法 将少量样品置于一个密闭的容器中，适当加热后并向液体连续吹入氮气，将易挥发的成分吹入另一个浓缩富集管中，然后热解吸进样色谱分析。 2.特点 操作简便，干扰少。特别是吹氮顶空法对样品的提取效率很高。,（二）水蒸汽蒸馏法,1.应用范围 适宜于分离和纯化挥发性化合物，如尿中酚、氟、氰化物等的分离。 2.过程 在进行水蒸气蒸馏前，需加酸或碱调节溶液的酸碱度，然后加热通入水蒸气蒸馏，挥发性化合物则随水蒸气一起被蒸馏

25、出来。收集一定体积的馏出液，取适量样液进行测定。 3.特点 该法操作较为繁琐，但提取效率高，分离效果好。,（三）溶剂萃取法,1.溶剂萃取法是利用待测组分与样品中的干扰杂质在互不相溶的两种溶剂中的分配系数不同而达到分离。 萃取分离使用的有机溶剂易挥发，经蒸干浓缩后，将残渣溶于小体积溶剂，使样品中待测组分得到富集。 2.萃取溶剂的选择 （1）应根据待测组分极性的强弱选择萃取溶剂，在保证萃取充分的前提下还要求有较高的选择性。 （2）应选用低沸点的溶剂，以便于萃取后易于除去溶剂。常用的有机溶剂有乙醚、三氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、甲苯和丙酮等。 （3）选用低粘度的溶剂有利于与样品基质的充分混合接触，提高

26、萃取效率。 3.消除乳化现象 有时需加入饱和氯化钠溶液，以消除乳化现象，提高萃取效率。 4.适宜于非挥发性有机化合物的分离。,（四）固相萃取法,1.固相萃取（solid phase extraction，SPE） 主要用于高沸点有机物样品分析前的净化和富集。 2.方法 将样品溶液导入预先经活化过的固相萃取柱，待测组分通过吸附、分配或离子交换等原理被萃取柱保留。 其他杂质组分不被保留，并可用适宜溶剂冲洗掉。 然后用另外一种溶剂把待测组分从固定相上洗脱下来，以达到分离、净化和富集的目的。 3.特点 溶剂用量少 萃取回收率高 重现性好 简便快速,4.萃取剂和洗脱剂的选择 首先根据待测组分的理化性质（如极性、pKa 、溶解度等）选择合适的固相萃取剂；并根据待测组分的性质和萃取剂来选择洗脱剂。 固相萃取剂分为吸附剂、高分子大孔树脂、离子交换树脂、键合硅胶等，最常见的是键合硅胶材料，如C8和C18。 如： 尿液中多环芳烃羟基代谢产物1-羟基芘，9-羟基苯并a芘和3-羟基苯并a 芘等经酶水解后，用C18固相萃取柱净化和富集； 尿液中环境雌激素经酸水解后用C18固相萃取柱净化和富集等。,（五）固相微萃取法,1.固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME )是一种新型的无溶剂的样品提取富集技术，在各种生物材料样品中药物代谢产物及兴奋剂