第14章 核酸的理化性质.ppt

1、0,第14 章 核酸的物理化学性质,DNA与RNA的差异（了解）,核酸的物理化学性质,核酸的化学结构和作为高聚物大分子决定着其物理化学性质。 核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解； 磷酸基和碱基：酸碱性质； 碱基：紫外吸收特性； 双螺旋结构：变性和复性。 DNA和RNA都微溶于水，不溶于有机溶剂，提取分离核酸时，可用乙醇将核酸从溶液中沉淀出来。,一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收性质 四、核酸的变性、复性及杂交,核酸的物理化学性质,一、核酸的水解,（一）酸水解 糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。 嘌呤碱基（DNA，37，pH 1.6）的糖苷键比嘧啶碱基（提高温度，175）的糖苷

2、键对酸更不稳定。 （二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸（2-OH基参与反应），产生2核苷酸和3核苷酸 。 KOH较好,水解后用HClO4中和，由于KClO4溶解度较小，溶液中大部分K+即被除去。,（1）底物 RNase核糖核酸 DNase脱氧核糖核酸 （2）按作用方式 核酸内切酶：作用点在多核苷酸链的内部 核酸外切酶（5 3外切酶、3 5外切酶） （3）按磷酸二酯键断裂的方式 5磷酸酯键 3磷酸酯键 （4）其他：双链酶、单链酶,非特异性水解磷酸二酯键磷酸二酯酶 专一性水解核酸磷酸二酯键核酸酶,限制性核酸内切酶: 细菌中，识别并切割特异的双链DNA序列的一种核酸内切酶，专门降解外

3、来入侵的异种DNA，对自身无害。,（三）酶水解,一、核酸的水解,二、核酸的酸碱性质,核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等电点。,三、核酸的紫外吸收,核酸最大吸收峰波长max在260nm处，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,1、判断样品的纯度 分别读出260nm和280nm的A值，计算A260/A280。 纯的DNA的应大于1.8；纯的RNA应达到2.0。 2、对纯核酸样品的定量测定 测出260nm的A值，即可计算含量。,三、核酸的紫外吸收P507,增色效应：由于DNA变性，引起的紫外光吸收增加的效应 。 减色效应：由于DNA复性，引

4、起的紫外光吸收下降的效应 。 原理：双螺旋结构使碱基对的电子云发生重叠，减少了对紫外光的吸收。,(一) 核酸的变性 指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。 注意： 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。 核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变 。 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高（热变性）、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,四、核酸的变性、复性及杂交P508,DNA的变性过程,骤然冷却,如何判断核酸是否变性呢？,热变性和Tm,螺旋双链开始分开,螺旋双链一半解开,螺旋双链完全解开,DNA的变性过程是爆发式的，它在很窄

5、的温度区间内完成。 通常把加热变性使双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温度，用Tm值表示 。 DNA的Tm一般在82-95之间。 RNA有局部双螺旋区， Tm较低；tRNA有较多双螺旋， Tm较高。,DNA的变性在紫外吸收上的变化,影响Tm的因素（了解）： 1.DNA的均一性越高，Tm的温度范围越小。例如poly d(G-C)，溶解过程发生在较小温度范围内。 2.G-C含量越高, Tm的值越大，当GC的含量上升1%，则Tm上升0.4。 经验公式：GC%=（Tm-69.3）2.44 3.介质的离子强度较高时, Tm的值较大，溶解范围小。,DNA制品不保存在极稀的电解质溶液中,（二

6、）核酸的复性,变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性 。 DNA复性后，许多物化性质得到恢复。 DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关，与DNA自身也有关系。,四、核酸的变性、复性及杂交P508,变性核酸复性时需缓慢冷却，故又称退火。 ,复性时的 初始浓度 重复序列 拷贝数等 片段大小,定义：热变性的DNA在复性过程中，具有碱基序列部分互补的不同来源的DNA之间或DNA与RNA之间形成杂化双链的现象。 核酸杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列（靶序列）。,（三）核酸分子杂交,四、核酸的变性、复性及杂交P508,Sou